基于网络药理学方法分析丁香酚治疗心肌缺血再灌注损伤的作用靶点及相关通路

韩运祺，石佳琦，朱秋梦，钱新宇，肖云峰，李文妍

1 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110；2 内蒙古自治区人民医院药学处

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）被认为是现阶段导致人类死亡的主要心血管疾病之一，具有发病迅速、病死率高的特点［1］。在MIRI 的治疗中，有许多中成药、中药汤剂和中药注射剂可作为常规治疗的辅助药物［2］。丁香酚是从丁香或其他含丁香酚芳香油的植物中分离得到的淡黄色稠性油状液体［3］。现代药理学研究显示，丁香酚具有多种药理活性，包括解热镇痛、抗炎、抗氧化、麻醉、改善学习记忆和神经保护等作用［4］。丁香酚的心脏保护作用已有报道，但其具体机制尚未可知。马强等［5］报道指出，丁香酚可以增强心肌细胞H9C2 的超氧化物歧化酶（SOD）活力、减少丙二醛（MDA）产生及乳酸脱氢酶（LDH）释放，从而明显升高过氧化氢（H2O2）诱导后的心肌细胞存活率，减少细胞凋亡。网络药理学是采用药理学、生物信息学等方法对药物与疾病之间的成分、靶点以及信号通路进行分析［6］。2022 年2月—3 月，本研究采用网络药理学方法分析丁香酚治疗MIRI的作用靶点和相关通路，为了解丁香酚治疗MIRI的相关机制提供思路。

1 材料及方法

1.1 丁香酚作用靶点收集 将“Eugenol”输入中药系统级药理学数据库TCMSP（https：//old. tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索框，限定词为“chemical name”，得出Eugenol 的CAS 号并记录，将所得CAS 号输入Pubchem（https：//pubchem. Ncbi . nlm. nih. gov）数据库得出SMILE 号。将SMILE 号导入Swiss（Swiss target prediction. ch）数据库得到Eugenol 的作用靶点，删去重复值，获得丁香酚作用靶点，导入Cyto⁃scape（https：//cytoscape.org/）软件中绘制丁香酚—靶点网络图。

1.2 MIRI 相关靶点收集 以“Myocardial ischemiareperfusion”为关键词，在OMIM（http：//www.omim.org/）、GeneCards（https：//www. genecards. org/）数据库进行检索，获得MIRI相关靶点，删去重复值。

1.3 丁香酚-MIRI 共同靶点筛选 在Venny2.1 在线软件作图工具平台上输入丁香酚作用靶点与MIRI 相关靶点，进行交集处理后，以韦恩图的形式展示丁香酚-MIRI 共同靶点，获得丁香酚治疗MIRI的潜在靶点。将上述所得的丁香酚-MIRI 共同靶点输入Cytoscape3.7.2 软件，绘制药物—靶点—疾病网络图，以便更清晰、直观地展示药物与疾病交集的靶点。

1.4 丁香酚治疗MIRI 核心靶点的筛选 将丁香酚-MIRI 共同靶点上传至String10.0（https：//stringdb.org）数据库，设置蛋白种类为“Homo sapiens”、最低相互作用阈值为0.4，获取靶点相互作用的网络关系数据；将其导入Cytoscape3.7.2 软件，绘制蛋白质互作网络（PPI）图，以节点的大小、颜色及深浅变化代表Degree 值的大小；将已经构建好的PPI 网络数据导入Cytoscape3.7.2 软件，使用MCODE（Mo⁃lecular Complex Detection）模块在庞大的网络中根据边和节点的关系进行聚类分析，寻找核心靶点。

1.5 丁香酚治疗MIRI 靶点的功能与通路富集分析 应 用Matescape（https：//metascape. org/gp/index.html）基因富集分析在线工具数据平台，对上述所得33 个丁香酚-MIRI 共同靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，GO 功能富集分析包括生物学过程、细胞成分和分子功能。

2 结果

2.1 丁香酚-MIRI 共同靶点筛选结果 共得到不重复的丁香酚作用靶点100个、MIRI相关靶点1 085个，丁香酚作用靶点网络图见OSID 码图1。绘制韦恩图后得到丁香酚-MIRI 共同靶点33 个，见表1 及OSID码图2、3。

表1 丁香酚-MIRI共同靶点筛选结果

2.2 丁香酚治疗MIRI核心靶点的筛选结果 丁香酚-MIRI 共同靶点的PPI 图显示共得到234 条边，其中Degree 值前6 位的作用靶点为蛋白激酶B-α（Akt1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、内皮一氧化氮合成酶3（NOS3）、甾体激素受体共激活因子（SRC）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK14），每个活性成分平均节点度7.09，PPI 富集P值为1×10−16，见OSID 码图4。基于聚类分析的核心靶点筛选结果显示共得到2个基因簇和2 个核心基因，核心基因分别为Akt1、VEGFA，见OSID码图5。

2.3 33 个丁香酚-MIRI 共同靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析结果 GO 生物功能富集分析结果显示，丁香酚-MIRI 共同靶点主要涉及的生物学过程包括蛋白质磷酸化的正向调节、离子平衡、细胞迁移等，主要涉及的细胞成分包括突触后膜、膜筏、微膜区等，主要涉及的分子功能包括蛋白激酶活性、血红素结合、转录因子等，见OSID 码图6。丁香酚-MIRI 共同靶点的KEGG 富集通路共有177 条，主要包括晚期糖基化终末产物（AGE）—糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Toll 样受体（TLR）信号通路等，见OSID码图7。

3 讨论

MIRI 是一种由于心肌组织缺血缺氧一定时间，恢复其供氧供血后心肌组织呈进行性加重的病理进程［7］。流行病学研究表明，目前MIRI 的病死率占心肌梗死病死率的41.7%［8］。MIRI的发生与氧化应激反应、钙离子超载、炎症反应、线粒体形态功能障碍等有关，但是其具体机制尚不明了［9］。中医药在治疗MIRI 方面有着独特优势，相比单一化合物，中药制剂具有多组分、多靶标、多路径、交互作用的特点，这也是对其进行机制研究时难度更高的主要原因［10］。本文利用网络药理学的方法，通过大数据挖掘，构建网络结构图，从而预测丁香有效成分丁香酚治疗MIRI的靶点及作用机制，为植物药材与现代化研究相结合提供了新的思路和策略。

丁香酚是天然药物，作为挥发油类物质多见于治疗缺血再灌注损伤的相关研究。SUN等［11］研究表明，丁香酚可通过调节p-mTOR/mTOR 而减轻脑缺血再灌注损伤。刘启祥等［12］研究显示，丁香酚可通过抑制NF-κB表达达到减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的作用。本研究基于网络药理学探究丁香酚治疗MIRI 的潜在作用靶点和相关通路，结果显示Akt1、VEGFA 可能是丁香酚治疗MIRI 的核心作用靶点。近来研究表明，蛋白激酶B（PKB，又名Akt）参与了细胞增殖、分化、血管生成、炎症反应等过程［13-14］。Akt 位于PI3K/Akt 途径的中心，是最重要的PI3K 下游靶标，心肌保护作用的部分机制依赖于Akt 蛋白的磷酸化［15］。研究证明，丹酚酸β 能有效降低MIRI大鼠的细胞凋亡指数，上调Bcl-2、p-Akt 蛋白表达，下 调Bax、Caspase-3 表 达，而PI3K/Akt 抑 制 剂LY29004 则具有相反的作用，提示丹酚酸β 通过调控PI3K/Akt 通路抑制心肌细胞凋亡［16］。已有研究证实，VEGFA 和血管紧张素1（Ang-1）可通过调节细胞增殖、抑制细胞凋亡和减少氧自由基释放，对缺血再灌注损伤后的心脏发挥保护作用［17］。除上述2个靶点外，MAPK 在PPI 图中也处于较核心的位置。MAPK 不仅在MIRI 中具有至关重要的作用，而且还参与了MIRI 的氧化应激及细胞凋亡过程［18］。MAPK 激活可加重心肌细胞损伤，降低心功能。因此，下一步实验可验证Akt1、VEGFA、MAPK 是否为丁香酚治疗MIRI 的作用靶点。本研究KEGG 通路富集分析结果显示，丁香酚可能通过AGE-RAGE、MAPK、TLR等信号通路参与治疗MIRI。

综上所述，丁香酚治疗MIRI的核心靶点主要有Akt1、VEGFA，主要涉及AGE-RAGE、MAPK、TLR 等相关通路；丁香酚可能通过蛋白质磷酸化的正向调节、离子平衡、细胞迁移等生物过程治疗MIRI，并涉及蛋白激酶活性、血红素结合、转录因子等分子功能。系统预测丁香酚治疗MIRI 的作用靶点与相关通路有利于进一步探索其作用机制，但是本研究不能完全证明预测结果的正确性，还需要开展体内外实验进行验证。