具核梭杆菌感染与高龄食管鳞癌患者临床病理特征及预后的关系

李超伟，张哲源，何珂瑶，张家豪，刘怡文，周福有，3

1 新乡医学院第三附属医院胸外科，河南新乡 453003；2 河南科技大学第一附属医院临床医学院分子生物实验室河南省微生态与食管癌防治重点实验室河南省肿瘤表观遗传重点实验室；3 安阳市肿瘤医院胸外科河南省食管癌精准防治医学重点实验室

食管癌的发病率和病死率极高，其病理类型主要包括鳞癌（ESCC）和腺癌（EAC），我国90%以上的食管癌患者是ESCC［1-3］。ESCC 早期临床症状不明显，确诊时大多已发展至中晚期，而中晚期ESCC 患者5 年生存率极低［4-6］。ESCC 好发于60～74 岁的老年人，≥75 岁的高龄患者也占有一定比例，而老年患者多存在生理机能和器官功能退化，对各种治疗方案的反应更差［7-8］。因此，寻找针对老年ESCC 患者的个性化治疗方案对于改善其预后至关重要。本团队前期研究已证实，具核梭杆菌（Fn）的长期定植可重塑肿瘤微环境、削弱机体抗肿瘤免疫反应，从而促进ESCC 细胞恶性增殖，显著缩短患者的生存时间［9-10］。本研究观察了Fn 感染与高龄ESCC 患者临床病理特征及预后的关系，以期为高龄ESCC 患者的早期预警及其预后改善提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019 年1 月—2020 年1 月安阳市肿瘤医院胸外科收治、拟行手术切除的高龄（≥75 岁）ESCC 患者106 例。纳入标准：①拟行治疗性ESCC 切除术，且术后病理诊断明确为ESCC，未合并其他肿瘤；②术前未接受放化疗和免疫治疗；③术后给予常规紫杉醇与顺铂联合（TP）方案辅助化疗，未接受放疗或免疫治疗；④临床资料完整。排除标准：①术前1 个月内使用过抗生素；②术后病理诊断为非ESCC，或合并有其他肿瘤；③术前接受过放化疗或免疫治疗；④术后未进行TP 方案辅助化疗，或接受过放疗、免疫治疗；⑤术后发生严重并发症或住院死亡。106 例高龄ESCC 患者中男64例、女42 例，吸烟44 例、饮酒34 例，有ESCC 家族史77 例，临床症状：吞咽哽噎103 例、吞咽疼痛9例、胸骨后不适4 例、腹部不适1 例，分化程度：低分化29 例、中高分化77 例，侵及纤维膜71 例，淋巴结转移63 例，临床分期：Ⅰ/Ⅱ期46 例、Ⅲ/Ⅳ期60例。本研究通过医院伦理委员会审核，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 ESCC 组织Fn 感染检测 采用Q-PCR 法。取患者术中切除的肿瘤组织，石蜡包埋。取3～8片10～20µm 厚度的石蜡切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇（体积分数分别为100%、90%、80%及70%）水化各5 min，采用DNA 提取试剂盒提取DNA，具体步骤参照吕小璐［11］的研究。采用Q-PCR 试剂盒进行扩增反应，Fn 引物及探针序列见表1。反应体系：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 µL，上下游引物（10 µmol/L）1 µL，Fn 探针0.5 µL，样本DNA（50 ng/µL）2.0 µL，ddH2O 6.5 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环，统计Ct 值，实验重复3 次后取平均值。阳性对照为Fn ATCC 25586 标准菌株DNA，阴性对照为实验室已鉴定Fn 阴性的ESCC 组织DNA 样本。Fn感染判定标准：Ct>35 定义为Fn 阴性；Ct≤35 定义为Fn 阳性［11］。

表1 Fn引物及探针序列

1.3 ESCC 组织Fn 16 S rRNA 表达检测 采用RNAscope 技术。取2 µm 厚度的ESCC 组织石蜡切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇（体积分数分别为100%、90%、80% 及70%）水化各5 min 后，采用RNAscope 靶标修复液修复15 min。采用双氧水孵育10 min，RNAscope蛋白酶孵育10 min。加入Fn探针，4 ℃孵育过夜，采用RNAscope 显色试剂进行显色。结果判定标准：ESCC组织癌细胞及间质细胞的细胞质中均可见弥散性红色颗粒，定义为Fn 16 S rRNA 表达阳性［9-10］；于400 倍光学显微镜下计数癌细胞内的红色颗粒数，Fn 在每个细胞中单独的红色颗粒≥8 个或有成簇的信号定义为阳性细胞，每张切片中阳性细胞比例≥30%为阳性标本。

1.4 随访方法 患者术后随访时间为2 年，记录生存状态，删失数据为随访至2年仍存活的患者，未删失数据为由ESCC 导致的死亡患者。生存时间为患者入院至最后一次随访或死亡的时间。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验，ESCC 组织中Fn 感染的RNA⁃scope与Q-PCR结果的一致性分析采用Cohen′s Kappa系数，Kappa值>0.7表示一致性显著、0.4～0.7表示一致性较好、<0.4 表示一致性较差。采用Kaplan-Meier 法绘制ESCC 组织Fn 阳性及阴性患者的生存曲线，生存时间分析采用Log-Rank 法。以ESCC 组织中Fn 感染（阳性=1，阴性=0）、性别（男=1，女=0）、吸烟（吸烟=1，不吸烟=0）、饮酒（饮酒=1，不饮酒=0）、家族史（有ESCC 家族史=1，无ESCC 家族史=0）、吞咽哽噎（有=1，无=0）、吞咽疼痛（有=1，无=0）、胸骨后不适（有=1，无=0）、腹部不适（有=1，无=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、浸润深度（侵及纤维膜=1，未侵及纤维膜=0）、淋巴结转移（阳性=1，阴性=0）、临床分期（Ⅲ/Ⅳ期=1，Ⅰ/Ⅱ期=0）为自变量，以随访2年时患者的生存状态为因变量，采用单因素COX 回归分析各临床因素对患者预后的影响；选择单因素分析中与预后有统计学关联的变量，并纳入混杂因素（性别、吸烟及饮酒），进行多因素COX回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 组织Fn 感染情况检测结果 Q-PCR 检测 结 果 显 示：106 例ESCC 患 者 中，Fn 阳性65 例（61.32%）、阴性41 例（38.68%）；RNAscope 检测结果 显 示：106 例ESCC 患 者 中，Fn 阳 性62 例（58.49%）、阴性44 例（41.51%），见OSID 码图1。ESCC 组织RNAscope 与Q-PCR 检测Fn 感染的结果具有显著一致性（Kappa 值为0.941，P<0.05），见表2。本研究采用Q-PCR检测结果进行后续研究。

表2 ESCC组织Q-PCR与RNAscope检测Fn感染的一致性分析结果［例（%）］

2.2 Fn 阳性与阴性高龄ESCC 患者的临床病理参数比较 Fn 阳性高龄ESCC 患者男性、吸烟、饮酒、有ESCC 家族史、有吞咽哽噎症状、分化程度为低分化、肿瘤侵及纤维膜、淋巴结转移阳性、临床分期为Ⅲ/Ⅳ期的比例均高于Fn 阴性患者（P均<0.05），见表3。

表3 Fn阳性与阴性高龄ESCC患者的临床病理参数比较［例（%）］

2.3 Fn 阳性与阴性高龄ESCC 患者的预后相关指标比较 106例高龄ESCC患者2年随访结束时生存64 例、死亡42 例（2 年生存率60.38%）；其中Fn 阳性高龄ESCC 患者生存28 例、死亡37 例（2 年生存率43.08%），阴性患者生存36例、死亡5例（2年生存率87.80%），Fn阳性高龄ESCC 患者的2年生存率明显低于Fn 阴性患者（P<0.05）。Fn 阳性高龄ESCC 患者的生存时间明显短于Fn阴性患者（P<0.05），见表4及图1。

图1 Fn阳性与阴性高龄ESCC患者的2年生存曲线

表4 Fn阳性与阴性高龄ESCC患者的生存时间比较（月）

2.4 Fn 感染对高龄ESCC 患者预后的影响 单因素COX 回归分析结果显示，吸烟、饮酒、ESCC 家族史、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期、Fn 感染均与高龄ESCC 患者预后有关（P均<0.05），见表5。多因素COX 回归分析结果显示，ESCC 家族史、肿瘤侵及纤维膜、淋巴结转移阳性、临床分期Ⅲ/Ⅳ期及Fn 阳性均是影响高龄ESCC 患者预后的独立危险因素（P均<0.05），见表6。

表5 影响高龄ESCC患者预后的单因素COX回归分析结果

表6 影响高龄ESCC患者预后的多因素COX回归分析结果

3 讨论

ESCC 的发生发展及预后与年龄密切相关。研究表明，50 岁以下的ESCC 患者数量明显少于50 岁以上的患者数量［12］。与低龄患者相比，高龄ESCC患者由于各项生理和器官功能退化，机体免疫微环境重塑，对放化疗及免疫治疗的反应更差，术后恢复能力更弱，生活质量更低［13］。因此，寻找高龄ESCC的致病因素及发病特点，对于其个性化防治策略的制定及改善患者预后至关重要。

ESCC的病因包括吸烟、饮酒、饮食、病原微生物感染、免疫功能紊乱及遗传易感性等。研究显示，病原微生物的慢性感染是多种肿瘤形成的始动因素［14］。人乳头瘤病毒、幽门螺杆菌及乙型肝炎病毒分别与宫颈癌、胃癌及肝癌的发生发展密切相关［15-18］。本团队前期研究发现，口腔条件致病菌Fn可随吞咽唾液或血液循环定植于ESCC 组织中，且Fn 可通过富集免疫微环境中具有负性调节功能的Treg细胞，使机体处于免疫耐受状态，协助肿瘤细胞逃避免疫监视［10］；Fn 还可诱导具有杀伤功能的CD8+T 淋巴细胞表面高表达抑制性受体KIR2DL1，削弱其杀伤功能，从而抑制机体抗肿瘤免疫反应［9］；Fn 可诱导ESCC 细胞中葡萄糖转运蛋白4 高表达，从而促进ESCC 细胞摄取葡萄糖，维持癌细胞能量供应，促进其恶性增殖［19］；Fn 还可通过诱导ESCC 细胞中NLRP3 高表达，引发机体炎症反应，协助肿瘤细胞化疗抵抗［20］。虽然Fn对ESCC的致病机制有待进一步探讨，但本团队前期已证实Fn 阳性的ESCC患者生存时间显著缩短［19-20］。为进一步探明Fn对高龄ESCC 患者预后的影响，本研究选择≥75 岁的高龄ESCC 患者为研究对象，分析Fn感染在高龄ESCC 患者中的感染特征及其对患者生存时间的影响，以期探明高龄ESCC患者预后差的原因。

本研究采用两种检测方法（RNAscope 与QPCR）检测106 例ESCC 患者癌组织中Fn 的感染情况，发现Fn 阳性率分别为58.49%、61.32%。虽然两种检测结果具有显著一致性，但由于RNAscope检测对样本处理要求严格、敏感度、特异度低，因此本研究后续分析采用更灵敏的Q-PCR 检测结果。本研究结果显示，Fn 阳性的高龄ESCC 患者多为有吸烟、饮酒史的男性患者，提示由于大多数男性患者长期吸烟、饮酒，口腔环境差，感染Fn 的风险增加；Fn感染阳性的高龄ESCC 患者有ESCC 家族史的比例显著升高，提示由于遗传易感性等因素，此类患者更易感染Fn；Fn阳性患者出现吞咽哽噎症状的比例明显升高，提示Fn 阳性的高龄ESCC 患者易出现吞咽哽噎症状；Fn 阳性患者肿瘤低分化的比例更高，提示恶性程度更高的肿瘤及其微环境更适于Fn定植；Fn 阳性患者肿瘤浸润深度增加、淋巴结转移率升高且临床分期多为Ⅲ/Ⅳ期，提示Fn 长期定植可促进癌细胞的恶性增殖、侵袭及转移。本研究生存分析结果显示，Fn 阳性患者的2 年生存率及生存时间均显著低于阴性患者，且ESCC 家族史、肿瘤侵及纤维膜、淋巴结转移阳性、临床分期Ⅲ/Ⅳ期及Fn感染是影响高龄ESCC 患者预后的独立危险因素，提示有效清除Fn 可能有助于延长高龄ESCC 患者的生存时间。

综上所述，有吸烟、饮酒史及ESCC 家族史的男性高龄ESCC 患者感染Fn 的风险升高，且感染Fn 的高龄ESCC 患者预后更差。由于ESCC 发病及进展的多样性和复杂性，Fn 的具体致病机制有待进一步探讨，但有效清除Fn 可延长高龄ESCC 患者的生存时间。本研究为高龄ESCC 早期预警和防治策略提供了参考依据。