下调CCN1表达抑制重症急性胰腺炎炎性反应

郭美霞 李敏利 吴晓尉 王 彬 张晓华

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是由多种病因导致的胰腺局部炎性和坏死，并且伴有全身性炎性反应和多器官功能损害的疾病，“炎症瀑布”反应学说是目前国际认可的发病机制之一。研究显示， SAP早期释放了大量炎性介质, 并且通过一系列生物级联放大效应, 释放促炎性细胞因子, 主要包括TNF-α、 IL-6等，这些炎性介质在SAP 发生、发展中起重要调节作用[1，2]。CCN1是一种分泌丰富的、富含半胱氨酸的、肝素结合的细胞外基质相关蛋白，被认为具有介导细胞黏附和诱导细胞迁移的功能。研究发现，CCN1作为一种新的促炎性细胞因子参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮的发病机制，提示CCN1作为炎性介质在炎症性疾病中扮演着重要角色，但CCN1在急性胰腺炎中的作用尚未见报道[3～5]。本研究通过观察CCN1信号通路与促炎性细胞因子在SAP早期炎性反应过程中的变化，进一步阐明SAP炎症发病机制。

材料与方法

1.材料和主要仪器:健康SPF级SD雄性大鼠36只，6～8周龄，体质量250g左右，购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司；CCN1shRNA质粒由威斯腾生物构建，肿瘤坏死因子α (TNF-α)和AMY的ELISA 试剂盒均购自中国北京丽科创欣生物科技有限公司；垂直板电泳转移装置、Trans-Blot转膜装置、电泳仪购自美国Bio-Rad公司，多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；一抗：CCN1(兔来源)，二抗：羊抗兔IgG均购自英国Abcam公司。

2.方法：(1)动物分组及SAP模型制备：SD大鼠随机分为空白对照组(control组)、SAP模型组(SAP组)和SAP+CCN1干预组(CCN1治疗组)，每组12只。术前12h禁食，饮水自由。实验大鼠称重，7%水合氯醛(5ml/kg)注射于腹腔进行麻醉，将大鼠仰卧位固定，取上腹正中切口，显露胰腺，确认胰胆管，以无创动脉夹于近肝门处夹毕胰胆管(近端于左右肝管汇合处远，端于近十二指肠处)；在贴近十二指肠开口处逆行穿刺胰管，以微量注射器注射4%牛磺胆酸钠，给药剂量1ml/kg，速度0.2ml/min；为保证牛磺胆酸钠充分进入胰腺，注射完毕后继续将胰胆管夹毕(约5min后胰腺组织出现肉眼可见的充血、水肿)；补充腹腔积液，确认腹腔内无活动性出血后两层关腹。对照组大鼠模拟胰胆管穿刺操作，但不予以注射任何药物。(2)给药方式：C组于造模前12h按照50微克/只的剂量尾静脉注射CCN1shRNA质粒，1次注射。A、B组于相同时间点注射等量0.9%氯化钠溶液。CCN1shRNA质粒的构建：在pLVX-shRNA2载体中构建CCN1shRNA。目的核苷酸序列:5′-GTGGAGTTAACAAGAAACA-3′。按照制造商的说明，使用EntransterTM-in vivo转染试剂进行转染，重组质粒测序验证并大量抽提。(3)取材时间点：SAP建模后6、12、18h。实验鼠称重并麻醉，开腹于腹主动脉取血，静置血液1～2h后离心(3000r/min，20min，4℃)，取上层血清于-20℃保存用于ELISA检测。取胰腺组织两份，一份放入4%多聚甲醛中4℃保存用于HE检测；另一份置于-80℃冰箱中保存用于Western blot法检测。

结 果

1.SAP组大鼠血清AMY水平的变化:与control组比较，SAP组大鼠血清AMY水平均明显升高，该效应与时间呈正相关，3个时间点中18h达最高水平，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)；CCN1治疗组大鼠血清AMY水平较SAP组明显下降，各组间比较，差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)。

表1 control组、SAP组及CCN1治疗组血清AMY水平变化

2.SAP组大鼠血清TNF-α表达情况:与对照组比较，SAP组血清TNF-α表达水平明显上调，并随着作用时间延长而逐渐升高，造模18h时升至3个时间点的最高值，与对照组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05，表2)；CCN1治疗组大鼠血清TNF-α表达较SAP组明显下降，各组间差异均有统计学意义(P均<0.05，表2)。

表2 control组、SAP组及CCN1治疗组血清TNF-α水平变化

3.胰腺组织病理学检查:依据Kusske评分标准，从分别从水肿、炎症、出血、坏死4个方面对各组病理进行评估比较，对照组大鼠胰腺结构未见明显异常，腺泡结构正常，排列整齐。SAP组6h胰腺小叶正常结构发生改变，间隙增宽，间质充血水肿；SAP组12h胰腺小叶结构破坏，可见少量片状坏死，部分间质血管破裂，并可见大量炎性细胞浸润，胰周脂肪液化坏死；SAP 18h组胰腺组织见大量坏死区，坏死区腺泡正常结构完全消失(图1)。与control组比较，各时间点大鼠胰腺病理评分比较，差异均有统计学意义(P均<0.05，表3)；CCN1治疗组大鼠胰腺小叶结构破坏、炎性细胞浸润较SAP组明显减轻，与SAP组比较，各时间点大鼠胰腺病理评分差异均有统计学意义(P均<0.05，表3)。

图1 大鼠胰腺组织病理切片(HE,×100)

表3 control组、SAP组及CCN1治疗组Kusske评分(分,

4.SAP大鼠胰腺CCN1表达情况:Western blot法检测结果显示，CCN1在control组大鼠胰腺几乎无表达，SAP组6h可见少量表达，随时间延长，CCN1表达上调，SAP 12h组表达明显增加，18h升至最高值，各时间点与control组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)；CCN1治疗组胰腺组织CCN1表达明显减少，各时间点与SAP组比较差异均有统计学意义(P均<0.05，图2)。

图2 CCN1蛋白表达检测1～3.control组6、12、18h；4～6.SAP组6、12、18h；7～9.CCN1治疗组6、12、18h；各组分别于6、12、18h检测大鼠胰腺组织CCN1蛋白表达

讨 论

重症急性胰腺炎在发病早期，胰腺腺泡细胞受损后胰酶释放、单核-吞噬细胞激活，大量的细胞因子释放，从而触发炎性介质瀑布样级联反应(cascades)，迅速导致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS)和多器官衰竭(multiple organ failure， MOF)。阻断胰腺炎早期炎症级联反应可作为突破口，寻找胰腺炎新的治疗靶点。

本课题组早期研究发现，TNF-α、IL-1、IL-6是急性胰腺炎的主要促炎性细胞因子，且血清及胰腺组织中的浓度随造模时间延长明显升高, 西地那非作用于牛黄胆酸钠诱导的急性胰腺炎大鼠中，发现TNF-α、IL-6基因表达明显被抑制后，胰腺炎症较对照组明显减轻[6～8]。本研究结果表明，TNF-α在SAP组大鼠血清浓度明显升高，与之前的研究结果一致，且于造模前12h按照50微克/只的剂量尾静脉注射CCN1shRNA质粒后，发现血清TNF-α及AMY浓度较SAP组明显降低，表明CCN1抑制剂可通过降低炎性介质TNF-α浓度，从而达到减轻炎症的目的。

既往研究发现CCN1可诱导炎性细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA及蛋白水平表达增加，且呈剂量及时间依赖性；分别用CCN1受体阻断剂即整合素αvβ3,FAK抑制剂，PI3K抑制剂及AKT抑制剂干预后发现NF-κB明显抑制[9]，提示CCN1参与炎性反应的发生、发展。CCN1因其在炎症中的作用而受到特别关注，本研究旨在探讨CCN1对牛磺胆酸钠诱导的急性胰腺炎大鼠模型的影响，结果表明，SAP组大鼠血清及胰腺组织中CCN1较control组明显增加，随着造模时间延长，CCN1浓度呈上升趋势，胰腺组织炎症坏死评分较正常对照组明显增加，说明CCN1在急性胰腺炎中呈时间依赖性，且与胰腺组织炎症程度呈正相关；经尾静脉注射CCN1shRNA质粒的急性胰腺炎大鼠，血清及胰腺组织中CCN1浓度明显降低，胰腺组织的炎症坏死较SAP组明显减轻。该方法对大鼠SAP模型具有良好的治疗效果，抑制CCN1可降低胰腺炎症、炎性细胞因子表达，这些发现支持了CCN1抑制剂在动物模型中的抗炎作用，这为研发急性胰腺炎新的治疗靶点提供依据。

综上所述，本研究证实了CCN1和TNF-α在急性胰腺炎中扮演重要角色，与炎症严重程度呈正相关，抑制了CCN1的表达，胰腺炎症明显减轻，但CCN1是否是这条信号通路的始动因素，是哪个信号因子激活了这条信号通路，是否还有其他炎性细胞因子参与其中，还需要开展进一步研究，这也是本课题组下一步的研究方向。