苦杏仁苷通过TSLP-DC-OX40L通路改善哮喘小鼠Th1/Th2免疫失衡的研究

周 欢 薛 征 刘亚尊 崔 雯 韩兆鹏 王雅娟 沈世平

哮喘是儿童肺部气道常见的慢性炎症性疾病，以气道炎症和气道重塑为两大病理学特征，其中气道炎症是哮喘发病的核心环节[1]。而气道炎症的发生主要在于Th1和Th2免疫细胞应答的不平衡，改善哮喘Th1/Th2免疫失衡是治疗哮喘的重要策略[2]。TSLP激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)过表达表面分子及共刺激分子，导致CD4+T细胞表现出Th2分化细胞的特征表型，并上调OX40L表达[3,4]。OX40L直接参与由TSLP介导的Th2细胞分化，且已有研究表明,TSLP和OX40L在气道炎症和高反应性的发展中至关重要[5]。苦杏仁苷(amygdalin, C10H27NO11)属氢苷类化合物，广泛存在于桃、杏、李子、苹果、山楂等蔷薇科植物种子中[6]。高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定苦杏仁苷为苦杏仁的主要有效成分之一[7]。现代药理学研究表明，其具有抗纤维化、抗炎、免疫抑制、免疫调节、抗肿瘤以及抗溃疡等作用[8]。目前苦杏仁苷研究多集中于抗肿瘤领域，对于干预哮喘研究较少。本研究通过分析苦杏仁苷通过TSLP-DC-OX40L信号通路干预支气管哮喘气道炎症作用机制及作用环节，为临床上治疗儿童哮喘提供新的理论证据。

材料与方法

1.实验动物与主要试剂:动物来源于南京生物医药研究所。雄性BALB/c小鼠，4～6周龄，体质量18～22g，饲养于上海市中医医院SPF级实验动物房，环境控制在室温24℃、湿度50%～70%环境中饲养，自由饮水与进食，1周后待4组小鼠适应环境后开始造模。卵白蛋白(ovalbumin,OVA)、苦杏仁苷购自美国Sigma公司。醋酸地塞米松片购自上海通用制药有限公司(批号：061002)。TSLP、IL-4和IFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。苏木精-伊红染液购自珠海贝索生物技术有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Sigma公司。anti-oX40L、anti-T-bet、anti-GATA-3均购自英国Abcam公司。

2.动物分组、造模及药物治疗：将雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组、苦杏仁苷组，每组10只。除空白组外，其余组小鼠均建立OVA诱导的哮喘小鼠模型。将10mg OVA和1mg氢氧化铝溶解于0.9%氯化钠溶液中，制成浓度为10%的致敏液进行腹腔注射两次，每次间隔两周。末次致敏7天后，将各组小鼠置于5L密闭容器中，用超声雾化器吸入5% OVA 0.9%氯化钠溶液30min，每天1次，持续1周。苦杏仁苷组按15mg/(kg·d)腹腔注射，空白组和模型组给予等量蒸馏水，地塞米松组将醋酸地塞米松片用蒸馏水配制成浓度为0.075mg/ml的溶液后灌胃。模型组和空白组均吸入等量的0.9%氯化钠溶液，均连续给药7天。

3.细胞培养：颈椎脱臼处死各组小鼠，取其股骨和胫骨、RPMI 1640培养基冲洗、分离、用RPMI 1640完全培养液配成2.5×104/ml的细胞悬液，加入GM-CSF(20ng/ml)+IL-4(10ng/ml)诱导，置于37℃、5%CO2培养箱培养至第72h起，每隔2天半换液，并加入全量细胞因子，收获DC。培养至第9天时，轻轻吹打培养基，然后吸出培养基，放入50ml离心管，用10ml新鲜培养基再洗下培养瓶，吸出再放入50ml离心管，两次合并一起离心(300r/min,5min)，弃上清，沉淀用完全培养基重悬，进行观察。

4.肺组织病理学分析:取小鼠右肺支气管组织，用10%甲醛溶液固定后，苏木精-伊红染色制备切片。在光镜下观察各组肺主支气管及周围组织形态学改变。

5.ELISA 分析：收集小鼠左肺支气管肺泡灌洗液，1000r/min,离心20min后取上清液；将上清液参照ELISA试剂盒说明书操作，在450nm处测吸光度值(A值)以测定标本中TLSP、IL-4、IFN-γ的实际浓度。

6.Western blot法检测：将肺组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000×g离心15min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。通过10% SDS-PAGE电泳分离蛋白(20μg)，并转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭2h。根据说明书 OX40L(1∶300)、T-bet(1∶500)、GATA-3(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)稀释抗体，和膜4℃孵育过夜。随后根据用量，按照1∶1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。取ECL发光显色液进行显影。

结 果

1.一般情况:哮喘模型小鼠治疗前表现为毛发竖立、烦躁不安、易受惊吓、气促、大小便失禁、用前肢抓挠口鼻等。空白组小鼠皮毛光亮，活动正常，无明显气短和大小便失禁。治疗7天后，空白组和模型组小鼠状态无明显变化，地塞米松组、苦杏仁苷组小鼠症状有所改善，但与空白组在精神状态、毛色和一般活动方面比较，差异无统计学意义。

2.肺组织病理学：经过7天的药物干预，空白组小鼠肺内细支气管壁及肺泡结构正常，气管黏膜上皮完整，管腔内无黏液渗出及炎性细胞浸润，管壁肌层及管周结构为正常肺组织。模型组肺内细支气管黏膜上皮受损，部分脱落，管腔内可见大量炎性渗出物，伴脱落上皮细胞充塞，管周充血水肿，细胞排列紊乱，有大量炎性细胞浸润，管壁平滑肌较空白组增厚；地塞米松组、苦杏仁苷组小鼠管周组织存在不同程度的炎性细胞浸润，支气管管壁结构完整，增厚不明显，其中地塞米松组浸润程度最轻，其次为苦杏仁苷组(图1)。

图1 苦杏仁苷对哮喘模型小鼠肺组织病理改变的影响(HE，×200)A.空白组;B.模型组;C.地塞米松组;D.苦杏仁苷组

3.ELISA分析:对BALF上清液中TSLP、INF-γ、IL-4水平的影响，与空白组比较，模型组、地塞米松组、苦杏仁苷组TSLP、IL-4水平明显升高(P均<0.05)，INF-γ水平明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，地塞米松组、苦杏仁苷组TSLP、IL-4水平明显降低(P均<0.05)，INF-γ水平均明显升高(P均<0．05)；与地塞米松组比较，苦杏仁苷组TSLP、INF-γ、IL-4水平差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ、TSLP水平比较

4.Western blot法检测:与空白组比较，模型组、地塞米松组、苦杏仁苷组OX40L、GATA-3蛋白的表达有明显升高(P<0.05)，T-bet蛋白表达明显下降(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组、苦杏仁苷组OX40L蛋白表达显著降低(P<0.05)，T-bet蛋白表达明显升高(P<0.05)；与地塞米松组比较，苦杏仁苷组OX40L、GATA-3、T-bet 蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

图2 各组小鼠肺组织中OX40L、GATA-3、T-bet蛋白水平与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

5.细胞培养:干预7天后体外培养DC1、2、3、6、9天，观察其细胞形态，培养24h后，于培养瓶底部可见体积较小的贴壁、半贴壁细胞，以圆形为主、呈均匀分布状态；培养48h后，细胞由均匀分布转为点状聚集，集落细胞数量不等，同时少量细胞出现悬浮状态；培养3天后，细胞体积较前增大，形态不规则，可见伪足样突起，部分细胞单个存在，并疏松黏附于瓶壁，少数细胞成簇抱团；培养6天后，大部分细胞体积继续增大，呈半悬浮生长，细胞表面突起增多、增粗，呈现典型的树突状或分支为星状，部分呈现梭形；培养9天后，树突状细胞基本脱壁生长，体积又继续变大，细胞刺突明显，且继续增长增粗，部分细胞可见细胞核，从形态学上看，此时DC基本培养成熟。与空白组比较，模型组、地塞米松组、苦杏仁苷组出现伪足样突起的时间较早且明显，细胞体积增大，集落细胞团形成增多；与模型组比较，地塞米松组、苦杏仁苷组伪足样突起少，体积较小，集落细胞团形成减少；与地塞米松组比较，苦杏仁苷组伪足样突起、体积和细胞团无明显差异(图3～图7)。

图3 体外培养DC光镜观察图(1天后)A.空白组；B.模型组；C.地塞米松组；D.苦杏仁苷组

图4 体外培养DC光镜观察图(2天后)A.空白组；B.模型组；C.地塞米松组；D.苦杏仁苷组

图5 体外培养DC光镜观察图(3天后)A.空白组；B.模型组；C.地塞米松组；D.苦杏仁苷组

图6 体外培养DC光镜观察图(6天后)A.空白组；B.模型组；C.地塞米松组；D.苦杏仁苷组

图7 体外培养DC光镜观察图(9天后)A.空白组;B.模型组;C.地塞米松组；D.苦杏仁苷组

讨 论

哮喘是一种异质性的慢性气道炎症疾病，常伴有气道高反应性与气道重塑，临床主要表现为喘息、呼吸急促、胸闷或咳嗽等症状[9]。根据国内研究者的大样本量调查显示，我国大部分城市儿童哮喘发生率明显上升，在过去的10年和20年，0～14岁儿童哮喘发生率分别增加了43.4%和147.9%[10]。

苦杏仁为中医经典名方中的常用药味，常常联用以发挥止咳平喘的作用。苦杏仁为蔷薇科植物杏的干燥成熟种子，味苦，性微温，归肺、大肠经，具有降气止咳平喘、润肠通便的功效，常用于咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘等症[11]。苦杏仁在常用方剂如麻黄汤、大青龙汤、麻杏石甘汤、厚朴麻黄汤、冷哮丸、蛤蚧定喘丸等作为君药或者臣药使用，对治疗哮喘起到了一定的作用[12]。基于数据挖掘技术研究中医药治疗儿童哮喘用药规律，最终检索文献数据3030篇，结果共纳入1040首方药，统计发现共涉及药物292味，高频药物50味，其中苦杏仁使用频次位于第2位[13]。同时有研究结果表明，苦杏仁苷可通过抑制炎性细胞因子的合成，减轻LPS所致的肺损伤，此外苦杏仁苷还能显著抑制NF-κB转录因子的激活，证明苦杏仁苷具有抗炎作用[14]。

树突状细胞(dendritic cell,DC)是哮喘发病的启动者，能促使CD4+幼稚T细胞活化并干预其分化方向，在启动免疫反应和维持免疫耐受方面发挥着关键作用[15]。DC在决定Th0 细胞向Th1或Th2细胞方向分化过程中起着关键作用，是控制Th细胞应答方向(Th1或者Th2)的基础。Th1和Th2淋巴细胞是CD4+T辅助细胞的两个主要亚群，在小鼠和人类中均有发现，其具有不同的功能，且分泌特征性的细胞因子。Th1和Th2处于动态平衡状态，维持机体正常免疫功能[18]。TSLP是一种强烈激活树突状细胞的上皮细胞源性细胞因子，在肺、皮肤和肠道中表达最多。一项研究表明，在哮喘气道中TSLP的表达增加，并且与Th2的趋化因子的分泌和疾病的严重程度相关[19]。TSLP通过上调MHC Ⅱ类分子和共刺激分子直接激活DC，提高OX40L的表达，促进细胞存活，诱导趋化因子分泌[20]。

在本研究哮喘模型中，地塞米松组、苦杏仁苷组小鼠肺泡灌洗液中INF-γ水平显著提高，TSLP、IL-4水平降低，肺组织中T-bet的蛋白表达增加，OX40L、GATA-3的蛋白表达减少，其中INF-γ与IL-4、T-bet与GATA-3值差异减小，Th1/Th2恢复平衡，本研究结果表明，苦杏仁苷可促进DC细胞成熟，降低OX40L的表达，促使Th0细胞向Th2细胞分化，影响TSLP介导DC对淋巴细胞的极化。结果提示苦杏仁苷可能通过TSLP-DC-OX40L通路调节Th1/Th2失衡参与哮喘发病和气道炎症，为苦杏仁苷防治哮喘提供了实验和理论依据，靶向TSLP通路改善哮喘气道炎症，为临床治疗哮喘提供了新的策略和理想药物的新靶点。