Mir-150和NKT细胞的激活对雌性小鼠Ⅰ型糖尿病的影响

梁俊漪 郑全辉

（华北理工大学，河北 唐山 063000）

microRNA（miRNA）是高度保守的短18-25核苷酸非编码RNA，可调控其靶基因的mRNA或蛋白表达[1]。有研究表明miR -150差异影响NK和iNKT细胞谱系的发育分化[2]。

与传统的T淋巴细胞相比，NKT细胞TCR不与经典的MHC编码的I类或II类分子呈递的肽抗原相互作用，而是识别非经典的抗原呈递分子CD1 d呈递的糖脂α-半乳糖苷神经酰胺（ α-Galcer）[3-4]。α-Galcer是iNKT细胞特异性激活剂，广泛应用于肿瘤、感染和自身免疫病等模型的干预研究[5]。

既往研究中如郑全辉等发现，Mir-150 缺失小鼠血糖值增高，促进小鼠Ⅰ型糖尿病的发生；α-Galcer促进了Mir-150 缺失小鼠T1DM的发生。而高丽清等研究发现，α-Galcer降低了STZ诱导的Mir-150KO小鼠发生T1DM。以上有关Mir-150对小鼠TIDM研究主要采用雄性小鼠，而Mir-150和NKT细胞对雌性小鼠Ⅰ型糖尿病的影响尙不能明确。所以，在此研究中，采用雌性小鼠，STZ处理制备I型糖尿病模型，用α-Galcer处理，观察NKT细胞激活对两种雌性小鼠T1DM发生发展的影响。

1 实验材料与方法

1.1 材料

（1）小鼠：雌性Mir-150基因敲除小鼠（Mir-150 knock-out,Mir-150KO）和野生型C57BL/6J小鼠最初购自Jackson实验室（Bar Harbor,ME,USA），小鼠在华北理工大学无致病性设施中饲养。小鼠实验操作按华北理工大学实验动物管理委员会规定进行。（2）试剂：链脲佐菌素（STZ）、柠檬酸钠和DMSO购自美国Sigma-Aldrich公司，NKT细胞特异激活剂α-Galcer购自瑞典Larodon公司，血糖仪及试纸条购自瑞士罗氏公司，荧光素标记的抗小鼠TCR-β 抗体（H57-597）和NK1.1抗体（PK136）购自美国BD 公司，鼠尾鉴定PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 实验方法

（1）miR-150KO小鼠基因型鉴定：miR-150KO小鼠基因型PCR鉴定以鼠尾DNA为模版，引物分别为：上游，5’-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3’；下游，5’-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3’。mi R-150 KO小鼠扩增产生长度为262 bp的DNA 片段，对照C57BL/6J小鼠扩增产生长度为866 bp的DNA片段。（2）小鼠分组：对于T1DM模型制备实验，选取5 ～8周龄雌性C57BL /6和Mir-150KO小鼠，分别分为STZ处理组和溶剂对照组。每组小鼠3 ～5只，实验重复3次。对于α-Galcer对T1DM影响实验，选取5 ～8周龄雌性C57BL /6和Mir-150KO小鼠，分别分为STZ单独处理组和STZ加α-Galcer联合处理组和溶剂对照组，每组小鼠6 ～8只，实验重复3次。（3）小鼠糖尿病模型制作：实验组野生型C57BL/6和Mir-150KO小鼠腹腔注射浓度为1 mg/100μL的STZ，150 mg/kg一次造模，试剂对照组小鼠采用等量柠檬酸钠缓冲液注射。取鼠尾血检测血糖，开始每12 h测量1次，连续测量3 d后改为每三天测量一次，连续测量3周。小鼠糖尿病判断标准为连续两次测定血糖浓度大于12.0 mmol /L。（4）小鼠α-Galcer处理：首先，将α-Galcer溶于DMSO中配置成浓度为1μg/mL的溶液,再用PBS稀释为浓度为6μg/100μL的溶液。注射α-Galcer，300 μg /kg，注射1次；溶剂对照组小鼠采用等量DMSO注射，注射1次。（5）流式细胞仪分析：分离小鼠的脾和淋巴结并制成单细胞悬液，用含2%小牛血清的PBS染色缓冲液洗涤，然后裂解红细胞，再洗涤并重悬，取出适量浓度的细胞加入2.4G2封闭，4℃ 10 min，然后直接加入适当浓度荧光素标记的单克隆抗体，4℃ 30 min。染色缓冲液洗涤两次，采用BD-LSRⅡ流式细胞仪收集标本，CellQuestPro （ BD Biosciences）软件进行数据分析。

1.3 统计学分析数据分析

采用SPSS Statistics统计软件或Microsoft Excel 统计软件组间差异t检验，P＜0.05为组间有统计学差异。

2 结果

2.1 Mir-150KO小鼠基因鉴定

Mir-150KO鼠尾DNA 经PCR扩增产生262 bp片段，对照C57BL /6J小鼠产生866 bp片段，miR-150KO小鼠基因鉴定正确，如图1所示。

图1 MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠基因型鉴定

2.2 Mir-150敲除促进小鼠糖尿病的发生

从STZ注射第0 d开始分别测量各组小鼠血糖变化，结果如图2所示。溶剂对照组Mir-150KO小鼠在实验期间的血糖水平始终略高于相应C57BL/6J小鼠，这与以前的报道一致。与溶剂对照组小鼠相比，STZ处组小鼠Mir-150KO和C57BL/6J小鼠血糖水平均增加。STZ处理中，Mir-150KO小鼠血糖水平均比C57BL /6J小鼠显著增高（*P＜0.05）。如图3所示，STZ注射组T1DM发病率Mir-150KO小鼠明显高于C57BL/6小鼠（*P＜0.05）。

图2 MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠的血糖变化

图3 小鼠T1DM发病率变化

2.3 α-Galcer处理降低雌性Mir-150KO和C57BL/6J小鼠的TIDM发生率

α-Galcer处理可显著增加Mir-150KO和C57BL/6J小鼠NKT细胞水平，如图4，差异明显（*P＜0.01）。用α-Galcer与STZ同 时 处 理Mir-150KO和C57BL/6J小鼠，3周后检测各组小鼠血糖，结果如图5所示，STZ注射组C57BL/6J和Mir-150KO小鼠的发病率明显低于α-Galcer与STZ同时处理组的小鼠（*P＜0.05）。

图4 经α-Galcer处理后Mir-150KO和C57BL /6J小鼠NKT细胞水平变化

图5 用α-Galcer与STZ同时处理Mir-150KO和C57BL/6J小鼠3周后血糖变化

2.4 NKT的细胞激活使Mir-150敲除小鼠的死亡率升高

研究发现，α-Galcer注射12 h左右后小鼠有死亡的现象，但是注射STZ的小鼠和溶剂对照组小鼠并没有发生死亡。其中，Mir-150KO小鼠中注射STZ+α-Galcer的死亡率最高为60%，如图6所示，α-Galcer的注射也就是NKT的细胞激活使Mir-150敲除小鼠的死亡率显著升高（*P＜0.05）。

图6 α-Galcer注射12 h左右小鼠生存情况

2.5 Mir-150 敲除小鼠注射后12 h血糖下降

将小鼠分为MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J小鼠两组。每组小鼠分别注射STZ+α-Galcer和单独STZ。从0 h开始每12 h测一次非空腹血糖，直至测量到144 h结束。如图7所示，注射STZ+α-Galcer的小鼠在12 h时血糖浓度下降到最低点2.1 mM。而单独注射STZ的小鼠并没有出现此现象（*P＜0.05）。

图7 注射STZ+α-Galcer的小鼠在12 h时血糖浓度变化

3 讨论

与以往的研究不同，本次实验采用了雌性小鼠。研究发现，雌性Mir-150敲除的小鼠T1DM 的发生率，明显要高于C57BL/6J小鼠。

有研究发现，通过α-Galcer激活自然杀伤性T细胞可防止自身免疫性1型糖尿病的发作和复发。造模后注射α-Galcer激活NKT细胞，T1DM的造模率确实比不注射时降低了，可以说NKT细胞的激活对糖尿病的发生起抑制作用。

当采用α-Galcer激活NKT细胞后，与雄性小鼠反应相似，无论是Mir-150 KO小鼠还是C57BL/6J小鼠，STZ诱导的TIDM发生率都有所降低。同时研究发现，雌性Mir-150KO小鼠与相应处理C57BL/6J小鼠相比死亡率显著升高。这个现象是雄性小鼠所没有的。

后续为了研究雌性Mir-150小鼠在α-Galcer处理后的死亡的原因，每12 h测量小鼠的血糖变化。研究发现，造模注射STZ后的12 h左右，注射α-Galcer的小鼠，MIR-150 KO小鼠和C57BL/6J均出现血糖下降过低的状态。未注射α-Galcer的小鼠则不明显。Mir-150小鼠的死亡与血糖浓度过低有关。