4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果

李 智 戴依娜 王 成 陈世玖

全球急性手外伤发生率为0.15‰～3.15‰，手部神经损伤将导致神经传导中断，会导致肌肉萎缩失去功能、感觉功能障碍，造成手部功能丧失，严重影响患者生活质量[1]。修复手部损伤神经、重建手部神经功能意义重大。同种异体神经移植是理想的治疗方案。本研究以患者放弃肢体的指固有神经作为研究对象，旨在评估甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇4种冷冻保护剂(cryoprotective agents，CAPs)的玻璃化保存效果，为人指固有神经玻璃化法保存提供一定的理论依据。

对象与方法

1.标本来源及处理:取在遵义医科大学第五附属(珠海)医院因外伤行截肢手术后患者放弃的肢体(共6例上肢，腕部水平离断1例，前臂离断3例，上臂离断1例，肩部离断1例)，患者无高血压、糖尿病及周围血管神经病变。肢体置于无菌操作台，剥离指固有神经至远端指间关节，剪成长度为1cm的神经片段，共75个片段，随机分为5组(4个实验组分别为30%DMSO组、甘油组、乙二醇组、丙二醇组和1个空白对照组)。

2.玻璃化保存：以胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI1640培养液、各组对应种类CAPs，按体积比为1∶6∶3配置玻璃化冻存液。处理分组后的神经片段分别放入装有4℃预冷的对应组的冷冻保护剂的冻存管中，在4℃中平衡30min，-20℃平衡2h，于-80℃冰箱过夜后投入液氮罐内深低温保存3周。3周后取出，直接放入40℃的水浴中快速复温，复温后加入含有0.5mol/L的蔗糖溶液中，洗脱10min，0.25mol/L蔗糖溶液，再次洗脱10min。

3.HE染色光学显微镜观察：每组取出5个标本，各截取0.5cm进行常规脱水固定、石蜡包埋、切片。按试HE染色剂盒(美国博士德生物公司)说明书进行染色操作，在400倍光学显微镜(日本Olympus公司)下观察神经组织结构。

4.玻璃化保存指固有神经的组织结构观察：取0.5cm长度神经标本，各组5条，按Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行孵化染色，防荧光淬灭剂封片，TCS-SP2 型激光扫描共聚焦显微(德国Leica 公司)，分别在490nm、545nm波长下观察荧光强度。

5.神经体外培养：复温后指神经Hank′s液洗涤3次，置于8孔细胞培养板的培养孔中，每孔2.5ml含有10%胎牛血清，100U/ml链霉素的H-DMEM培养基， 37℃、5%CO2培养箱内培养7天，每2天更换培养液1次。

6.ELISA法检测玻璃化保存后神经的NGF：取培养后神经用0.01mol/L的PBS液冲洗，称取湿重，按200mg组织加入1ml三蒸水的比例，进行组织匀浆，2500r/min离心20min后，取上清液。严格按照人神经生长因子ELISA试剂盒(美国博士德生物公司)说明书操作，依照试剂盒说明及标准品浓度，建立标准曲线，每组设置3个复孔。在波长450nm酶标仪(美国 PerkinElmer 公司)上测定A值；以A值为纵坐标，标准品浓度横坐标，建立标准曲线，根据样品A值找出对应浓度。

结 果

1.玻璃化保存指固有神经组织结构：HE染色后光镜下观察，空白对照组神经鞘膜结构散乱，神经纤维排列疏松、紊乱，局部有脱髓鞘改变；甘油组、丙二醇组神经鞘膜偶见断裂，神经纤维结构较松散，脱髓鞘改变均较轻；30%DMSO组间神经鞘膜完整性更好，神经脱髓鞘改变更轻；乙二醇组神经鞘膜最完整，神经纤维排列整齐、紧凑，脱髓鞘改变最轻(图1)。

图1 玻璃化保存3 周人指固有神经病理切片(HE，×400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO组;D.甘油组;E.丙二醇组

2.玻璃化保存指固有神经生物活性：Calcein-AM/PI双染色，激光共聚焦显微镜观察，结果显示，空白对照组神经纤维绿色荧光(代表活细胞)轻度较弱，红色荧光(代表死细胞)强度较强，且广泛分布；实验组与空白对照组比较，绿色荧光较强，红色荧光弱；实验组内，甘油组及丙二醇组神经荧光强度相似，绿色荧光强度最弱，红色荧光强度最强；30%DMSO组于前两组比较绿色荧光较强，红色荧光较弱；乙二醇组绿色荧光最强，红色荧光最弱，分布范围有限(图2)。

图2 人指固有神经激光扫描共聚焦显微(Calcein-AM/PI，×400)A.空白对照组;B.乙二醇组;C.30%DMSO组;D.甘油组;E.丙二醇组

3.ELISA法检测培养神经的神经生长因子(NGF)水平:人指固有神经玻璃化保存3周后，空白对照组NGF(12.95±3.03pg/ml)水平最低，其次是甘油组(61.47±3.34pg/ml)、丙二醇组(62.53±3.64pg/ml)、30%DMSO组(109.51±9.98pg/ml),乙二醇组(112.64±3.54pg/ml)NGF水平最高；空白对照组与4个实验组间比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。实验组间比较，甘油组与丙二醇组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，其余各实验组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

讨 论

周围神经损伤是创伤外科较为棘手的问题，自体神经移植作为神经损伤修复金标准[2]。受到供区并发症、取材长度限制、神经直径匹配度低等限制[3～5]。同种异体神经具有天然的神经结构，提供适合神经再生的基质及生长因子，其来源广泛、匹配度高，在周围神经损伤治疗中具有优势[6～8]。

深低温保存技术能有效地降低异体移植的免疫原性，延长移植神经的时效性。但降温过程对细胞及组织却是致命打击。细胞外冰晶形成导致细胞溶质浓度增高，造成细胞脱水、细胞膜结构及蛋白功能受损，形成“溶质损伤”,细胞内冰晶直接导致细胞死亡[9～11]。玻璃化保存通过高浓度CAPs及超高的冷却速率，使细胞内外液体形成玻璃态，从而有效避免冰晶形成[12,13]。渗透性CAPs通过提升液体玻璃化转换温度及降低溶剂冰点，减少了降温过程中细胞内外冰晶[14]。解冻过程中渗透性CAPs还可以抑制冰晶再形成导致的二次损伤，进一步保护组织复温后的组织结构。不同CAPs对组织保护效果存在差异，因其发挥作用的机制不同，DMSO与丙二醇通过改变双分子层的排列进而起到细胞保护作用，甘油与乙二醇则通过与磷脂分子形成氢键发挥保护作用[10，14]。

周围神经损伤后的再生过程中施万细胞(schwann cells,SCs)发挥积极作用。损伤后SCs失去轴突支配，成熟的SCs通过基因调控去分化为具有修复状态的祖细胞，称为修复施万细胞[15]。修复施万细胞引起髓鞘自噬，募集巨噬细胞清除损伤神经断端周围的组织碎片，减缓局部炎性反应，为神经轴突再生提供合适环境[16]。同时神经断端间由巨噬细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞等形成“神经桥”，SCs沿着神经桥生长形成中控管道，为轴突再生提供支架。SCs生长过程中分泌大量的神经生长因子，营造再生微环境。自体神经移植联合SCs移植修复神经损伤能有效修复运动功能与感觉功能[17，18]。

根据神经营养因子表达差异，SCs可分为运动型施万细胞和感觉型施万细胞，NGF、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1在感觉神经施万细胞中高表达。研究发现，感觉型施万细胞对运动神经与感觉神经在再生具有较强的引导作用，这是由于NGF的受体TrkA仅在感觉神经中表达引起，所以NGF的浓度水平可以反映诱导感觉神经再生的能力[19]。

周围神经损伤发生后神经断端的NGF表达上调后：①促进SCs引起髓鞘自噬，推进髓鞘碎片的清除；②引导SCs沿“神经桥”迁移，协助再生神经支架形成；③为新生轴突提供合适的再生微环境，促进轴突再生；④促进修复施万细胞的再髓鞘化，由此可见，NGF是神经再生微环境中重要的组成部分。而微环境中较高浓度的NGF可以维持神经的再生状态[20，21]。人造神经支架由于缺少合适的再生微环境，其修复能力弱于自体神经移植，当加入外源性神经生长因子后神经再生速率与准确性得到明显提升[22]。研究发现，CAPs可以改变玻璃化冻存的细胞线粒体mRNA的表达，SCs对NGF分泌作用受多种基因信号调控，本实验中，不同组神经组织匀浆中NGF的含量差别可能与CAPs对SCs活性的保护作用有关，同时不能排除CAPs对SCs内NFG分泌相关基因调控的影响[23,24]。

综上所述，同种异体神经移植作为理想的修复材料，玻璃化保存可延长使用时限。本实验结果证实，4种CAPs对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用，其中乙二醇效果最佳，更适合用于人指固有神经玻璃化保存。本研究旨在为人指固有神经玻璃化保存提供一定的理论基础，希望后续可以找到更加适合人指固有神经的玻璃化保存方法，为周围神经损伤再生修复提供新的治疗手段。