miRNA-21对糖尿病肾病诊断效能的Meta分析

钟 柯 黄 钦 方雅萱 倪清颖 何振洋 杨 波

糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病患者最重要的微血管病变之一，是导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因， 随着糖尿病发生率的上升，由其引起的ESRD的发生率由2000年的22.1%升至2015 年的 31.3%[1]。目前通过控制血糖、调节血脂以及降低血压等基础治疗难以阻止DKD的进展，且针对DKD的特异治疗手段亦不尽如人意。 因此，如何延缓DKD的进展仍然是一个重要的临床及社会难题[2]。而有效诊断并及时干预是解决此类问题的关键。临床上，微量白蛋白尿是评估DKD进展的重要指标，然而仅依靠白蛋白尿评估DKD的严重程度或预后并不准确[3]。再者，虽然肾活检作为诊断DKD的金标准，但由于肾穿刺存在肾周血肿、动静脉瘘、出血、感染等风险，以及给患者造成严重的心理负担和消耗过多的医疗资源等问题，难以在DKD患者中全面推广[4，5]。因此探寻一种新的敏感、特异、快速诊断糖尿病肾病的方法是防止糖尿病肾病患者死亡的关键。

microRNAs (miRNAs)是一类长度为19～25个核苷酸(nucleotide，nt)，具有高度保守性的非编码RNA分子，在动物体内通过部分互补结合到目的mRNA的3′非编码区(3′untranslated regions, 3′UTRs)，进而在转录后水平调控基因表达，抑制蛋白质合成。由于其在体液中的稳定性以及易于检测性，miRNAs已经成为诊断许多疾病的重要生物学标志物[6]。已有研究表明，miRNA-21在多种糖尿病并发症中升高，因此miRNA-21可能成为诊断糖尿病肾病的新的生物学标志物[7]。但目前国内外关于miRNA-21诊断糖尿病肾病的准确性尚无定论，故本研究旨在通过Meta分析确定miRNA-21是否可作为糖尿病肾病的预测性生物学标志物，以综合客观评价miRNA-21对糖尿病肾病的诊断价值。

资料与方法

1.资料来源：计算机检索Embase、PubMed、Web of Science、中国知网(CNKI)、万方数据库、维普数据库(VIP)、中国生物医学文献数据库(CBM)搜集miRNA-21与糖尿病肾病的相关性研究，检索时间从建库至2021年4月。英文检索词为microRNA-21、miRNA-21、Mir21、miR-21、Diabetic Nephropathies、Nephropathy, Diabetic、Diabetic Kidney Disease、Diabetic Glomerulosclerosis、Kimmelstiel-Wilson Syndrome、Diagnosis、Sensitivity、Specificity，中文检索词为microRNA-21、微小RNA-21、miR-21、MIR21、糖尿病肾病、糖尿病性肾小球硬化症、肾小球硬化症、糖尿病性肾病、诊断、敏感性、特异性。

2.纳入标准:(1)研究类型：miRNA-21诊断糖尿病肾病的诊断性试验。(2)研究对象：为确诊糖尿病肾病的患者，对照组为健康人或其他糖尿病患者；年龄>18岁，无性别、民族等要求。(3)标准：临床诊断和(或)病理诊断为糖尿病肾病的患者。(4)结局指标：合并敏感度(sensitivity，Sen)、合并特异性(specificity，Spe)、合并阳性似然比(positive likelihood ratio，PLR)、合并阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)、诊断比值比(diagnosis odds ratio，DOR)和合并受试者工作特征曲线(summary receiver operator characteristic curve，SROC)以及曲线下面积(area under curve, AUC)等。(5)文献明确说明是研究miRNA-21与糖尿病肾病诊断的关系,并能完整提取四格表数据。

3.排除标准:①重复发表文献；②非miRNA-21及糖尿病肾病的文献;③研究对象为细胞系或动物；④综述、病例报告、会议记录、毕业论文；⑤数据不可信或无法提取四格表的文献。

4.资料提取、文献质量评价：两名研究者独立进行文献检索并根据纳入、排除标准进行筛选，提取的数据包括第一作者、发表年份、地区、诊断标准、糖尿病肾病程度、年龄、检测方法、样本量、cut-off值，真阳性数(true positive, TP)、假阳性数(false positive, FP)、假阴性数(false negative, FN)、真阴性数(true negative, TN)、敏感度、特异性，如若纳入研究原文中未出现TP、FP、FN、TN，仅有ROC曲线的试验，则通过Plot Digitizer软件分析获得。两名研究者再根据Revman软件中的Quadas-2量表对纳入的文献进行质量评价，Quadas-2量表是一种诊断准确性研究质量评估工具，主要通过病例的选择、待评价试验、金标准、病例流程和进展情况评估每篇文章的偏倚风险[8]。在文献提取和质量评价过程中，两名研究者如若遇到分歧、意见不一致则与第3各研究者协商解决。

5.统计学方法：利用Stata15.1以及Meta-Disc1.4软件进行数据分析，在诊断试验中引起异质性的原因有阈值效应和非阈值效应。利用Meta-Disc1.4软件计算出Spearman相关系数r, 分析是否存在阈值效应，随后通过诊断价值比(diagnostic odds ratio, DOR)的Cochran-Q检验探讨非阈值效应引起的异质性，若异质性检验P>0.1 时，表明所纳入研究无异质性，用固定效应模型。若异质性检验P≤0.1时，表明所纳入研究存在异质性，用随机效应模型，其中AUC值为≥0.5且≤0.7、>0.7且≤0.9、>0.9且≤1.0分别表示低、中、高诊断准确率。随后通过Meta分析中的回归、亚组和敏感度分析探索与阈值效应无关的异质性来源。计算纳入文献的合并敏感度、合并特异性、阳性似然比、阴性似然比、DOR、SROC曲线以及曲线下面积等。

结 果

1.文献筛选流程及结果：通过设定的检索词，共检索出379篇文献。根据纳入和排除标准，最终纳入7篇研究[9～15]。文献筛选流程及结果详见图1A。

图1 文献筛选流程及偏移分布A.文献筛选流程及结果;B.Quadas-2纳入文献的质量评价及偏倚分布

2.纳入研究的基本特征和质量评价：本文共纳入7项研究，共涉及882例样本，其中糖尿病肾病患者525例，对照病例357例，纳入研究的基本特征详见表1。使用Quadas-2评价系统评价文献发表质量及偏倚风险(图1B)。结果表明，所纳入的7篇研究的文献质量属于中高水平。从风险偏倚来说，可能对结果存在一定的偏倚影响。

表1 纳入研究的基本特征

3.阈值效应：利用Meta-Disc1.4软件分析得出敏感度对数和(1-特异性)对数之间Spearman相关系数为0.143(P=0.760>0.05)，提示本次研究不存在阈值效应异质性。通过绘制对称SROC曲线并没有出现“肩臂状”，更进一步证明以上结论。

4.非阈值效应异质性：诊断价值比DOR的Cochran-Q检验得出Cochran-Q=19.09，P=0.0040，因此本研究存在非阈值效应引起的异质性。故采用随机效应模型进行Meta分析。结果为：合并敏感度为62%(95% CI:58%～68%)，见图2A，合并特异性为73%(95% CI：68%～78%)，见图2B。PLR为2.50(95% CI：1.79～3.50)，见图2C，NLR为0.43(95% CI：0.31～0.60)，见图2D。DOR为6.29(95% CI：3.36～11.79)，SROC曲线下AUC面积为0.7889(图3A)，故表明miRNA-21对糖尿病肾病有中等的诊断率。且本次研究的敏感度、特异性、阳性似然比、阴性似然比、DOR的I2均>50%，表明异质性较大，随后寻找异质性来源。

图2 miRNA-21诊断糖尿病肾病森林图A.miRNA-21诊断糖尿病肾病合并敏感度分析；B.miRNA-21诊断糖尿病肾病合并特异性分析；C.miRNA-21诊断糖尿病肾病合并阳性似然比；D.miRNA-21诊断糖尿病肾病合并阴性似然比

图3 SROC曲线和敏感度分析A.miRNA-21诊断糖尿病肾病的SROC曲线；B. miRNA-21诊断糖尿病肾病的敏感度分析

5.敏感度分析：利用Stata15.1软件对上述7项研究进行敏感度分析， 结果如图3B，发现王钱虎等[10]的研究对结果影响较大，随后重新阅读此项研究，发现其选择病例为早期糖尿病肾病，而其他研究的病例为非早期糖尿病肾病，所以可能结果产生较大影响，故剔除此项研究。

6.Meta回归分析与亚组分析：通过单变量Meta回归分析，纳入文献的异质性可能来源于诊断标准(是否有肾活检报告)、地区、样本量、糖尿病肾病的年龄，见图4A。随后根据诊断标准(是否有肾活检报告)进行亚组分析，分析结果见表2。结果显示miRNA-21在有肾活检报告的研究与无肾活检报告的研究相比有更高的敏感度(77.9% vs 62.9%)和特异性(83.6% vs 72.9%)以及有更低的异质性(敏感度I20 vs 93.9%, 特异性I20 vs 87.5%)， 有肾活检报告的研究与无肾活检试验报告的研究相比有更高的DOR(17.986 vs 4.544)和更高的AUC(0.8802 vs 0.7516)。因此miRNA-21在糖尿病肾病中的诊断效价可能接近于肾活检。

图4 Meta回归分析及发表偏倚A.miRNA-21诊断糖尿病肾病的Meta回归分析；B.Deek′s漏斗图评估miRNA-21诊断糖尿病肾病的发表偏倚

表2 亚组分析计算结果

7.发表偏倚：使用 Stata 15.1制作 Deek′s漏斗图，结果提示纳入研究无明显发表偏倚，见图4B(Bias=17.42154，P=0.27)。

讨 论

糖尿病进展到后期，易诱发循环系统疾病，其中糖尿病肾病为其常见并发症，不仅给患者及其家庭带来了沉重的精神和经济压力，也成为社会的繁重负担。因此，糖尿病肾病的早期诊断不仅是公共卫生及临床检验的重大挑战，而且对提高糖尿病患者的生存率和改善生活质量具有重要意义[16]。近年来，miRNAs已经被认为是许多疾病完美的诊断、治疗和预后生物学标志物[17～20]。miRNA-21是最具代表性的miRNAs之一[21]。研究发现miRNA-21可以通过调节Smad7的表达影响糖尿病肾病的进展[22]。此外，Ahmed等[23]研究发现，抑制miRNA-21可以导致人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and rensin homolog，PTEN)的表达减少，从而通过影响肾小球系膜细胞中Akt/mTORC1信号通路，降低mTORC1的活性，导致肾小球系膜扩张和细胞外基质沉积减少，最终有效治疗和预防糖尿病肾病。因此，miRNA-21有可能用作糖尿病肾病新兴的生物学标志物，以帮助DKD的早期诊断。然而，这些结果尚未得到证实，因此这项Meta分析对于确定miRNA-21对糖尿病肾病的诊断价值有重要意义。

本系统评价一共纳入7项研究，共涉及882例样本，累计糖尿病肾病患者病例525例，对照病例357例，系统地回顾了miRNA-21诊断糖尿病肾病的临床研究。采用Meta分析的方法，客观地评估了miRNA-21对糖尿病肾病的诊断价值， Meta分析结果显示miRNA-21诊断糖尿病肾病的合并敏感度为62%，合并特异性为73%，说明miRNA-21对于诊断糖尿病肾病具有一定的价值。合并阳性似然比和阴性似然比分别为2.50和0.43，表明糖尿病肾病患者miRNA-21阳性的可能性是正常对照组的2.5倍，43%的个体结果为阴性，这进一步证实了miRNA-21在糖尿病肾病中的诊断意义。合并的诊断价值比为6.29，SROC曲线下AUC面积为0.7889，则表明miRNA-21对糖尿病肾病诊断效果中等，能较好地诊断糖尿病肾病。

SROC曲线图显示各研究对应的点散在分布，不呈“肩臂”状分布，以DOR为效应量，纳入研究存在重度异质性，其可能是由于纳入研究的样本主要来自于中国，因此miRNAs的表达可能存在地区差异。此外，实时荧光定量PCR (quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)作为目前最准确的miRNAs定量方法，其总RNA的提取过程以及标准化内参的选择也可能是异质性的潜在来源[24]。因此这些因素可能会影响miRNAs的表达水平的检测值。本研究中Spearman相关系数为0.143，提示异质性与阈值效应无关，Deek′s漏斗图未检验到已发表的偏倚，因此异质性的来源主要由非阈值效应引起。随后对诊断标准、地区、样本量以及糖尿病肾病年龄进行亚组分析，发现miRNA-21在有肾活检报告的研究中有更高的DOR(17.986 vs 4.544)和更高的诊断效能(AUC：0.8802 vs 0.7516)，这可能与没做肾活检的研究纳入的糖尿病肾病患者可能存在假阳性有关。因此，miRNA-21在糖尿病肾病的诊断效价可能接近于肾活检。众所周知，肾组织病理活检是糖尿病肾病诊断的金标准，但因其检测过程有创性，临床应用受到限制。此外，肾活检有潜在的并发症，如出血、肉眼血尿、动静脉内瘘以及血管和周围器官损伤等[25]。因此miRNA-21作为无侵入性的诊断手段，可以在糖尿病肾病的诊断中成为新的无创生物学标志物。

糖尿病以及糖尿病并发症已经成为一个公共卫生问题引起了人们的关注，并且由于它的流行，成为一个巨大的经济负担，而miRNAs由于其独特的生理特性在诊断和治疗糖尿病及糖尿病并发症中显示出巨大的潜力[26]。有研究表明，通过靶向miRNA142-3p/Tet2/Foxp3轴，有效干预调节性T细胞的不稳定性从而改善1型糖尿病中自身免疫的激活和进展[27]。并且在糖尿病性视网膜病变中，miRNA-126、miRNA-21、miRNA-181c、miRNA-1179 的血清表达水平和miRNA-21、miRNA-155 的血浆表达水平的失调，可作为该疾病的标志物并且监测该疾病进展[28]。尤其是近年来许多研究已经发现肾组织、外周血和尿液中 miRNA-21 的特异性变化通过不同的信号通路和靶点调节炎性反应、氧化应激、代谢异常、免疫反应和纤维化，从而影响糖尿病肾病的发生和发展[22,23,29]。这些研究都进一步证明了miRNA-21在诊断和治疗糖尿病肾病的巨大潜力，这可能是未来研究的领域。

本研究具有一定的局限性：①纳入研究大多数为中国地区，无法代表其他地区，因此将该结果外推时需谨慎;②纳入的文献仅包含中英文，一定程度上存在语言上的偏倚;③纳入文献所含病例数较少， miRNAs研究在方法学差异和生物学效应方面存在显著的异质性，因此需选择更大样本量，更高研究质量的文献进行 Meta分析来验证、完善本研究的结果。

综上所述，本研究认为miRNA-21是一种快速的、无创的诊断糖尿病肾病的方法，其对糖尿病肾病的临床诊断具有一定价值。但目前miRNA-21在临床研究中缺乏大样本的数据论证，因此纳入文献的质量和数量等限制,还需要进一步的高质量的研究予以验证。但随着研究的进一步深入，miRNA-21在糖尿病肾病的临床诊断中具有广泛应用前景。