TNF-α/hs-CRP双标记时间分辨荧光免疫法用于脓毒症早期筛查诊断的研究

李云鹏，郝培远，曹雪明，闫兆月，王恩锋，黄书满，代荣钦△

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征，如不及时治疗，可致器官衰竭和休克，也是重症监护病房患者（包括婴幼儿、儿童等）死亡的主要原因之一。脓毒症早期症状不明显，病情进展较快，病死率可达30%～70%［1］。因此，脓毒症早期诊断对最佳治疗时机的选择十分重要。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达与炎症反应关系密切，是重要的促炎介质之一，可诱发白细胞介素（interleukin，IL）-6等次级炎性因子水平升高和白细胞数量的增多，导致过度炎症反应。研究认为，TNF-α介导的炎症反应是导致脓毒症损伤的重要机制之一［2］。超敏C-反应蛋白（hypersensitive Creactive protein，hs-CRP）属于炎症类物质，机体发生细菌感染时hs-CRP水平会迅速升高，可以作为脓毒症早期诊断的标志物［3］。研究发现，炎性因子的检测可用来预测脓毒症的发生、发展以及治疗效果评估，多指标同时检测可提高检测的准确性［4-5］。然而，可同时进行检测的技术较少，能满足同时检测多指标的试剂更少。双标记时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）采用镧系元素铕（Eu3+）和钐（Sm3+）作为标志物，是一种可实现双指标同时检测的超微量免疫分析技术，具有灵敏度、特异度高，线性范围宽等特点［6］，可满足脓毒症多炎性因子的同时检测。本研究拟建立一种双标记TRFIA 法用于检测血清TNF-α和hs-CRP 水平，以期为脓毒症的早期筛查、疗效评价和预后评估等提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料和仪器 收集2020年5月—2021年10月收治的70 例脓毒症阳性患者的血清样本，其中46 例来自河南省人民医院，余24例来自华中阜外医院；男45例，女25例，年龄12～55 岁，平均（28.3±14.9）岁。阳性：体温＞38.3 ℃或者体温＜36 ℃；心率升高、血压降低、血糖升高、精神状态不佳，白细胞计数（WBC）＞12×109/L，血浆C-反应蛋白升高，血浆降钙素原升高、高乳酸血症等。同期健康体检阴性血清样本者100例，男52例，女48例，年龄15～45岁，平均（29.4±12.8）岁，均来自河南省人民医院。阴性：没有临床脓毒症的症状，血常规、尿常规、血压血糖等正常。2 组性别（χ2=2.537）、年龄（t=0.515）差异无统计学意义。抗TNF-α 包被抗体（编号3E2）、检测抗体（编号5B3），抗hs-CRP 包被抗体（编号4E2）和检测抗体（编号10D3）以及TNF-α 和hs-CRP 标准抗原购自广州优迪生物科技股份有限公司；Eu3+和Sm3+标记试剂盒、Sephades-G50 填料和时间分辨荧光免疫检测仪（型号Victor 1420）均购自PerkinElmer 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自Fitzgerald 公司；96 孔反应板购自Costar公司。

1.2 反应板包被 以50 mmol/L、pH=9.6 的碳酸盐缓冲液将抗TNF-α包被抗体和抗hs-CRP包被抗体分别稀释到2 mg/L，加入96 孔反应板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；拍干包被液，5% BSA 封闭，每孔250 μL，37 ℃孵育2 h；拍干封闭液，0.5%吐温-20（Tween-20）的PBS 洗涤3 次，拍干后真空冷冻干燥，4 ℃冰箱保存。

1.3 Eu3+和Sm3+抗体偶联物制备 参考试剂盒说明书和参考文献［7］行Eu3+、Sm3+抗体偶联。

1.4 试剂盒组装 将TNF-α标准品母液分别稀释成0、0.1、1、10、50 及100 ng/L，将hs-CRP 标准品母液分别稀释成0、0.1、1、10、50 及100 mg/L；均1 mL/瓶分装后冻干。Eu3+和Sm3+抗体偶联物分别分装，10 mL/瓶。分析缓冲液20 mL/瓶、洗涤液50 mL/瓶、增强液20 mL/瓶。将上述成分和反应板放置于纸质试剂盒中，组装成TRFIA法检测试剂盒。

1.5 TRFIA 试剂盒检测血清TNF-α 和hs-CRP 水平 向包被反应板中依次加入25 μL的血清样品或标准品、100 μL分析缓冲液、100 μL Eu3+和Sm3+抗体偶联物，室温振动孵育1 h。洗涤液洗涤6 次，最后每孔加入200 μL 增强液，振摇5 min后，在Victor 1420全自动时间分辨荧光免疫分析检测仪检测荧光值。

1.6 TRFIA试剂盒性能评估

1.6.1 标准曲线的绘制 使用1.4中制备的TRFIA试剂盒测定TNF-α/hs-CRP标准品，每个标准品浓度设置重复3次，平行测定3次，计算各标准品荧光值的平均值，进行线性拟合，得到标准曲线及其相关系数。试剂盒灵敏度参照文献［8］方法确定。

1.6.2 准确度和精密度试验 将TNF-α和hs-CRP标准品母液分别用阴性血清稀释为低（TNF-α：1 ng/L；hs-CRP：2 mg/L）、中（TNF-α：10 ng/L；hs-CRP：50 mg/L）和高（TNF-α：50 ng/L；hs-CRP：100 mg/L）3个质量浓度，每个质量浓度进行10次平行检测，计算检测平均值、标准差（standard deviation，s）、变异系数（coefficient of variation，CV）以及加标回收率（测定浓度/加标浓度×100%）。

1.6.3 特异性试验 用TRFIA 试剂盒检测血清中常见的干扰物质：降钙素原（procalcitonin，PCT）标准品（100 μg/L）、人血清白蛋白标准品（100 μg/L）、纤维蛋白原标准品（100 μg/L）和基质金属蛋白酶（MMP）-9标准品（100 μg/L），每个样本设置重复3 次，计算交叉反应率（检测值/理论值×100%），结合试剂盒对TNF-α和hs-CRP检测阈值，评估检测特异性。

1.6.4 稳定性试验 TRFIA试剂盒分别存储于4 ℃6个月和37 ℃7 d，对试剂盒的外包装进行评估，并测定各标准品的荧光值，计算荧光值变化率=|稳定性试验前荧光值-37 ℃7 d或4 ℃6个月荧光值|/稳定性试验前荧光值×100%，确定试剂盒的稳定性。

1.6.5 检测阈值的确定 采用本试剂盒分别测定100例健康志愿者血清中TNF-α 和hs-CRP 的水平，分析正态性并确定95%CI，计算TNF-α 和hs-CRP 的参考值的上限，即检测阈值。

1.7 临床样本对比检测 70 例脓毒症阳性血清样本，15 份健康志愿者阴性血清样本，采用TRFIA 试剂盒进行检测，对比检测结果与临床结果，以确定本试剂盒筛查脓毒症的准确性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用±s表示，采用Excel 软件，以TNF-α和hs-CRP 标准品浓度为横坐标，其对应的荧光值的对数值为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果

2.1 标准曲线 TNF-α标准曲线方程：Y=0.037 1X+0.913 2，R2=0.992 7，线性范围0～100 ng/L；hs-CRP标准曲线方程：Y=0.037 4X+1.028 4，R2=0.990 6，线性范围0～100 mg/L。见图1。平行测定10 次浓度为0的参考标准品的荧光值，得到本TRFIA 试剂盒对TNF-α的检测灵敏度为0.05 ng/L，对hs-CRP的检测灵敏度为0.02 mg/L。

Fig.1 Standard curves of TRFIA kit for detecting TNF-α and hs-CRP levels图1 TRFIA试剂盒检测TNF-α和hs-CRP水平的标准曲线

2.2 准确度和精密度试验结果 TNF-α高、中、低3个质量浓度的加标回收率为92.00%～107.00%，hs-CRP 的高、中、低3 个质量浓度的加标回收率为95.00%～106.82%。TNF-α批内CV为4.57%～9.24%，批间CV为5.13%～9.27%；hs-CRP 批内CV为3.57%～7.69%，批间CV为6.07%～10.00%，批内和批间的CV均≤10.00%，见表1。

2.3 特异性试验结果 血清中常见的干扰物质的检测值均较小，得到的交叉反应率均小于2%；且检测值均小于TNF-α 和hs-CRP 的检测阈值，结果判定为阴性，即高浓度的干扰物质不影响检测结果判定，见表2。

Tab.2 The specific test results of TRFIA kit表2 TRFIA试剂盒特异性试验结果

2.4 稳定性试验结果 37 ℃7 d热破坏性试验示试剂盒外包装无明显变化，各标准品荧光值未随着时间的改变而发生明显改变，荧光值变化率均小于1.5%；4 ℃冰箱中储存6 个月，试剂盒外包装无明显变化，各标准品荧光值亦未随时间的改变而发生明显改变，荧光值变化率均小于2.5%，见表3。

2.5 检测阈值确定结果 血清中TNF-α 检测阈值为0.44 ng/L；hs-CRP检测阈值为1.41 mg/L。

2.6 临床样本对比检测 70 例临床阳性样本，TRFIA 试剂盒检测结果均为阳性；15 份临床阴性样本，TRFIA 试剂盒检测结果均为阴性。本TRFIA 试剂盒检测结果与临床情况相一致，符合率100%。

Tab.3 The stability results of TRFIA kit表3 TRFIA试剂盒稳定性实验结果

3 讨论

脓毒症是机体应对感染时过度激活免疫系统，引起全身炎性因子的瀑布式释放，从而导致器官及组织衰竭的一种综合征，致死率高，全球范围内每年脓毒症发病人数多达1 800万，因脓毒症导致的死亡人数每天将近1 400 例［9-10］。婴幼儿和儿童因其身体器官发育尚不成熟，抵抗力较差，更容易受到脓毒症的损害［11］。因此，准确、高效地检测脓毒症特异性标志物的变化，预测脓毒症的发生与发展，对脓毒症患者的医治具有重要指导意义。临床上对脓毒症感染检测指标选择较多，有白细胞、中性粒细胞等，但其用于诊断感染的准确率较低［12］。脓毒症作为一种炎性疾病，炎性因子（TNF-α、IL-6等）在其疾病发展初期已开始被分泌并释放到血液中，多种炎性因子的检测可用来预测脓毒症的发生、发展以及治疗效果等［13］。对于炎性因子的检测，临床上有多种方法，如酶联免疫吸附测定法、放射免疫法、化学发光法和TRFIA等，检测性能各有优劣，TRFIA因其可进行双指标同时检测而备受关注。

双标记TRFIA方法作为一种新兴的免疫检测方法，已广泛用于临床样本检测、食品检测以及兽医学检测等多个领域［13-14］。其具有高灵敏度、高特异性，适合临床样本分析的优势，是单标记诊断方法的良好替代［14］。本研究结果显示，TNF-α在0～100 ng/L范围内检测线性较好，hs-CRP 在0～100 mg/L 范围内检测线性较好，检测灵敏度分别为0.05 ng/L 和0.02 mg/L，可满足临床检测的需要；TNF-α 和hs-CRP 的加标回收率90%～110%，批内与批间CV均小于10%，表明本TRFIA 法检测TNF-α 和hs-CRP的准确度和精密度较高，达到了临床样本检测要求；稳定性试验结果显示，该TRFIA试剂盒稳定性较好；比对试验表明，该TRFIA 试剂盒能够准确地筛查脓毒症临床样本。计算得到的参考阈值说明当血清TNF-α≥0.44 ng/L、hs-CRP≥1.41 mg/L 时，患者有发生脓毒症的危险。欧赛英等［15］建立的吖啶脂化学发光法最低TNF-α 检测限为0.245～0.519 ng/L，线性范围5～1 000 ng/L，回收率为92.6%～104.9%，总CV＜10%。本检测方法的灵敏度高于上述检测方法，线性范围小于上述方法，准确性和精密度等同。双标记TRFIA 检测hs-CRP 和脂蛋白（a）的研究显示，对hs-CRP 检测灵敏度为0.052 mg/L，批内批间CV均小于10%［16］。本研究TRFIA法检测hs-CRP的分析性能与上述TRFIA等同。因此，笔者认为，与其他检测方法相比，TRFIA是一种应用前景广、可实现多指标同时检测的新型技术。

综上所述，本研究建立的TNF-α/hs-CRP 双标记时间分辨免疫荧光试剂盒具有高灵敏度和高特异性的优点，能够实现对TNF-α/hs-CRP 的快速检测，可作为辅助脓毒症早期筛查的技术手段在临床推广应用。