去肾交感神经对2型糖尿病大鼠血管内皮细胞自噬及NLRP3活化的影响

王勇，牛伟华，卢成志△，许梦萍，徐建强，何强，许学升

2020年中国2型糖尿病（T2DM）防治指南指出，我国糖尿病患病率仍在上升，2015—2017 年达到11.2%，其中90%以上为T2DM。糖尿病常导致血液流变学、微循环和细胞代谢的紊乱，进而引起心、脑、肾和视网膜等重要靶器官的损害，其中以血管病变最为严重，可加速动脉粥样硬化进展，且心血管事件是糖尿病患者死亡的主要原因［1］。血管内皮功能障碍主要表现为内皮依赖性血管舒张功能受损，是动脉粥样硬化的早期标志之一［2］。近期研究表明，去肾交感神经（renal denervation，RDN）能有效治疗高血压［3-4］，同时改善血管内皮功能障碍［5］，但具体机制尚未阐明。本研究通过观察RDN对T2DM大鼠血管内皮细胞自噬和核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）炎症小体表达的影响，初步了解RDN改善T2DM 大鼠血管内皮功能的机制，为RDN 治疗T2DM 引起的血管内皮功能障碍提供理论依据及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD 大鼠30 只，6周龄，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［生产许可证号：SCXX（京）2019-0002］，于中国医学科学院放射医学研究所饲养。大鼠适应性喂养3 d，采用随机数字表法分组：（1）对照组（CON组，n=6），给予普通饲料喂养。（2）高脂组（HFD 组，n=24），给予高脂饮食喂养12 周后，采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射30 mg/kg 的方法制备T2DM大鼠模型，1周后剪尾取血，空腹血糖≥11.1 mmol/L 为造模成功［6］。随机抽取18只建模成功的大鼠，再次采用随机数字表法分为糖尿病对照组（T2DM 组，n=6），双侧假手术组（Sham组，n=6），双侧手术组（RDN组，n=6）。

1.1.2 主要药品、试剂及仪器 STZ（美国Sigma 公司），苯酚（济南米乐化工有限公司），无水乙醇（济南汇丰达化工有限公司）。10%苯酚无水乙醇溶液：苯酚溶液置于水浴箱加热2 h，取10 mL 苯酚，再取90 mL 无水乙醇，充分混匀后装于200 mL的瓶中。戊巴比妥钠（北京华业寰宇化工有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），血糖试剂盒、胰岛素试剂盒（上海哈灵生物技术有限公司），去甲肾上腺素（NE）试剂盒、血管性血友病因子（vWF）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司），乙酰胆碱（Ach）、硝普钠（SNP）、NE（美国Sigma公司），酪氨酸羟化酶（TH）抗体（武汉博士德生物工程有限公司），通用二步法免疫组化检测试剂盒（PV-9000，北京中杉金桥生物技术有限公司），抗Beclin1、LC3、p62 抗体（美国CST 公司），抗NLRP3、胱天蛋白酶（Caspase）-1、活化的Caspase 3（cleaved Caspase-3）、白细胞介素（IL）-1β抗体（北京博奥森生物有限公司），抗内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体（英国EterLife公司），抗β-actin抗体（美国Abbkine公司），羊抗兔二抗（碧云天公司）；TIANScript cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，无创血压计BP-98A（日本Softron），血糖测试仪（强生稳豪），620M离体微血管张力测定系统（丹麦ADInstrument），PowerLab多导生理记录仪（澳大利亚AD），H-7650透射电镜（日本日立），实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 血压和心率的测量 采用尾套法测量基线状态、RDN术前及术后4周大鼠的血压及心率。

1.2.2 RDN模型的建立［7］大鼠术前12 h禁食，4 h禁水，腹腔注射戊巴比妥钠100 mg/kg 麻醉，腹部正中切口，暴露肾脏，用弯头无齿镊分离出肾动脉，在解剖显微镜（×25）下找出肾动脉所有可见的肾神经，RDN组用细头棉签蘸取溶于10%苯酚无水乙醇溶液抹双侧肾动脉周围2 min达到充分去神经效果，Sham组予以生理盐水涂抹2 min，不破坏肾神经。术后前3 d腹腔内注射庆大霉素8万U/d预防感染，常规进食水。

1.2.3 血液标本采集及保存 分别于基线状态、RDN术前及术后4周，禁食12 h清晨眼内眦静脉取血2 mL，3 000 r/min离心10 min，取出上清液于-80 ℃保存，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、NE、vWF、NO水平及肾脏组织中NE的水平，具体操作严格按照说明书进行。

1.2.4 标本取材、肾动脉HE 染色以及TH 阳性神经纤维检测 RDN 术后4 周处死大鼠，剪取整段肾动脉及周围组织。生理盐水漂洗后，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片（范围包括近、中、远段），HE 染色观察肾动脉周围组织，免疫组化分析肾动脉中TH 阳性神经纤维，具体操作严格按照说明书进行。所得图像经Image Pro Plus软件进行定量分析，每张切片在高倍镜下观察，阳性表达为棕黄色，以积分光密度（IOD）为指标进行图像分析，计算5个高倍显微镜下的平均IOD值。

1.2.5 透射电镜观察内皮细胞中的自噬结构 取各组大鼠胸主动脉切成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 大小，2.5%戊二醛固定后再经锇酸固定，乙醇丙酮脱水，环氧树脂包埋，切片后醋酸钠、柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄片，分析主动脉血管内皮细胞自噬体的变化情况。

1.2.6 血管环张力实验 处死大鼠后，迅速切取4 mm 左右的胸主动脉，保存于生理盐溶液（PSS），仔细剔除周围脂肪和结缔组织，悬吊于盛有10 mL，37 ℃PSS液的离体血管恒温浴槽中，持续95%O2和5%CO2混合气体；通过PowerLab 多导生理记录仪分析血管张力的变化，浴槽内基础张力调至1.0 g，并设定为基线值。当动脉环稳定于基线水平时，向水浴槽中加入1 μmol/L 的NE，使动脉环收缩达到最大反应后，稳定15 min，加入10 μmol/L 的Ach 观察预收缩血管舒张程度，如果预收缩血管舒张可达到60%～90%，可以认为内皮完整，反之则认为内皮受损。给予NE收缩血管达到最大反应后稳定30 min，加入内皮非依赖性血管舒张剂SNP（1×10-6mol/L），检测血管舒张功能。将Ach浓度梯度设为1×10-9～1×10-4mol/L，SNP浓度梯度为1×10-10～1×10-5mol/L，对比4组大鼠的Ach和SNP浓度-舒张效应曲线。

1.2.7 实时荧光定量PCR 法检测胸主动脉内皮细胞NLRP3 mRNA 表达 RDN 术后4 周，用Trizol 提取组织样本中总RNA，取5 μL RNA 用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，根据试剂盒说明书进行操作。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，见表1。反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

Tab.1 Primer sequences for PCR analyses表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.8 Western blot 法检测主动脉内皮细胞蛋白表达 取适量主动脉加蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔加蛋白质约30 μg 行SDS-PAGE 电泳，电泳后再将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上（湿转），脱脂牛奶封闭。一抗Beclin1、LC3、p62、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、cleaved Caspase-3、β-actin 抗体（均为1∶1 000），eNOS 抗体（1∶800）4 ℃孵育过夜。洗膜孵二抗（1∶5 000），室温下放置2 h，洗膜，曝光显色，凝胶成像系统分析蛋白的相对表达量。β-actin作为内参，采用Quantity One软件进行半定量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以±s表示。在满足方差齐性的条件下，组间多个均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线状态及RDN 术前各组大鼠资料比较 高脂喂养前4组大鼠的收缩压（SBP）、心率（HR）、FPG、FINS、NE、vWF、NO 水平差异均无统计学意义，见表2。RDN 术前，与CON 组比较，T2DM 组、Sham 组、RDN组大鼠SBP、HR、FPG，FINS、NE、vWF水平明显升高，NO 水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；T2DM组、Sham组、RDN组间两两比较差异无统计学意义，见表3。

2.2 RDN 术后4 周各组大鼠SBP、HR、FPG 等指标及肾脏NE 水平比较 与T2DM 组和Sham 组比较，RDN 组SBP、HR、FPG、FINS、NE、vWF 及肾脏NE 水平明显降低，NO 水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），T2DM组与Sham组间各指标比较差异无统计学意义，见表4。

2.3 RDN 术后4 周肾动脉HE 染色及TH 阳性表达情况 HE 染色显示，正常肾动脉血管外膜结构完整，血管周围可见大量神经纤维，RDN 组肾动脉血管外膜局部缺失，结构不完整，血管周围未见明显神经纤维，见图1。RDN术后4周，免疫组化结果显示，CON 组、T2DM 组、Sham 组和RDN 组的IOD 值分别为0.295±0.019、0.447±0.035、0.445±0.028、0.310±0.011;与T2DM 组和Sham 组比较，RDN 组肾动脉TH表达水平降低，差异有统计学意义（F=60.724，P＜0.01），见图2。

Tab.2 Comparison of baseline parameters between the four groups表2 各组大鼠基线状态指标比较 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of baseline parameters between the four groups表2 各组大鼠基线状态指标比较 （n=6，±s）

均P＞0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

Tab.3 Comparison of parameters before RDN between the four groups表3 RDN术前各组大鼠指标比较 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of parameters before RDN between the four groups表3 RDN术前各组大鼠指标比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON组比较，P＜0.05。

2.4 RDN 对胸主动脉内皮细胞中自噬体的影响 RDN 术后4 周，透射电子显微镜下可见CON 组内皮细胞各细胞器结构清晰，仅有少量自噬体，自噬体与溶酶体融合形成较大的自噬溶酶体，自噬溶酶体内可见正在降解的受损的线粒体，见图3A、B；T2DM 组和Sham 组可见线粒体嵴裂溶解消失，靠近线粒体双层膜部位残留少量线粒体嵴结构，未见明显自噬体，见图3C、D；RDN 组可见线粒体嵴排列紊乱，线粒体基质区域部分蛋白降解形成空泡化，自噬小体为双层膜结构，内含被吞噬的细胞器，见图3E、F。

2.5 RDN 对胸主动脉内皮舒张功能的影响 RDN术后4 周，与CON 组比较，T2DM 组大鼠主动脉内皮舒张功能明显降低；与T2DM 组和Sham 组比较，RDN 组的主动脉对SNP 和Ach 舒张率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5、6。

2.6 RDN 对胸主动脉内皮细胞自噬相关蛋白和cleaved Caspase-3、eNOS 蛋白的影响 RDN 术后4周，与CON组比较，T2DM组、Sham组和RDN组大鼠自噬蛋白Beclin1、LC3 水平明显降低，p62 水平明显升高，凋亡蛋白cleaved Caspase-3 水平升高，eNOS水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与T2DM 组和Sham 组比较，RDN 组Beclin1、LC3、eNOS水平明显升高，p62、cleaved Caspase-3 水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），T2DM组和Sham组比较差异无统计学意义，见表7，图4。

2.7 RDN 对胸主动脉内皮细胞NLRP3 mRNA 及NLRP3 炎症相关蛋白表达的影响 RDN 术后4 周，与CON 组比较，T2DM 组、Sham 组和RDN 组大鼠NLRP3 mRNA及蛋白表达，Caspase-1、IL-1β蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与T2DM组和Sham组比较，RDN组NLRP3 mRNA及蛋白表达，Caspase-1、IL-1β 蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），T2DM组和Sham组比较差异均无统计学意义，见表8、图5。

Tab.4 Comparison of parameters after RDN between the four groups表4 RDN术后4周各组大鼠指标比较 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of parameters after RDN between the four groups表4 RDN术后4周各组大鼠指标比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON组比较，b与T2DM组比较，c与Sham组比较，P＜0.05。

Fig.1 Comparison of histological characteristics between chemical ablated renal nerves and normal renal nerves (HE staining,×400)图1 正常肾动脉与RDN后肾动脉周围神经组织染色比较（HE染色，×400）

Fig.2 The expression of tyrosine hydroxylase(TH)staining in the renal artery at the end of 4 weeks after RND(Immunohistochemical staining,×400)图2 RDN术后4周肾动脉TH表达（免疫组化染色，×400）

Fig.3 Changes of autophagosome in rat aortic endothelial cells observed by transmission electron microscope (×5 000)图3 透视电子显微镜观察胸主动脉内皮细胞自噬体的变化（×5 000）

Tab.5 Effects of SNP on the endothelial relaxation function of aorta at the end of 4 weeks after RND in the four groups表5 RDN术后4周各组间SNP对胸主动脉内皮舒张功能的影响 （n=6，%，±s）

Tab.5 Effects of SNP on the endothelial relaxation function of aorta at the end of 4 weeks after RND in the four groups表5 RDN术后4周各组间SNP对胸主动脉内皮舒张功能的影响 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON组比较，b与T2DM组比较，c与Sham组比较，P＜0.05；lg（SNP）为SNP浓度取常用对数值。

Tab.6 Effects of SNP on aortic relaxation to acetylcholine(Ach)at the end of 4 weeks after RND in the four groups表6 RDN术后4周各组间Ach对胸主动脉内皮舒张功能的影响 （n=6，%，±s）

Tab.6 Effects of SNP on aortic relaxation to acetylcholine(Ach)at the end of 4 weeks after RND in the four groups表6 RDN术后4周各组间Ach对胸主动脉内皮舒张功能的影响 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON组比较，b与T2DM组比较，c与Sham组比较，P＜0.05；lg（Ach）为Ach浓度取常用对数值。

Tab.7 Comparison of Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表7 RDN术后4周各组间胸主动脉内皮细胞Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白水平比较 （n=6，±s）

Tab.7 Comparison of Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表7 RDN术后4周各组间胸主动脉内皮细胞Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白水平比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON 组比较，b与T2DM 组比较，c与Sham 组比较，P＜0.05。

3 讨论

Fig.4 Beclin1,LC3,p62,cleaved Caspase-3 and eNOS protein levels at the end of 4 weeks after RND图4 RDN术后4周各组Beclin1、LC3、p62、cleaved Caspase-3、eNOS蛋白表达

Tab.8 Comparison of expression levels of NLRP3 mRNA and other inflammatory proteins in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表8 RDN术后4周各组胸主动脉NLRP3 mRNA、蛋白及炎症蛋白表达水平比较 （n=6，±s）

Tab.8 Comparison of expression levels of NLRP3 mRNA and other inflammatory proteins in the thoracic aorta at the end of 4 weeks after RND between the four groups表8 RDN术后4周各组胸主动脉NLRP3 mRNA、蛋白及炎症蛋白表达水平比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON 组比较，b与T2DM 组比较，c与Sham 组比较，P＜0.05。

Fig.5 NLRP3,Caspase-1 and IL-1β protein levels at the end of 4 weeks after RND图5 RDN术后4周胸主动脉内皮细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达

T2DM 引起的大血管病变严重影响患者的生活质量，是致死、致残的主要原因。高血糖导致的血管内皮功能障碍是心血管疾病的基础。交感神经兴奋可促进葡萄糖的利用，增加脂肪分解和糖异生，并减少胰岛素分泌，然而胰岛素抵抗可使肾上腺素分泌增多，导致交感神经过度兴奋，两者之间形成恶性循环［8］。大量临床研究及流行病学调查发现T2DM 患者交感神经活性升高［9-10］。本研究结果发现，与CON 组相比，给予高脂饮食联合小剂量STZ 诱导的糖尿病大鼠模型HR增快、全身及肾脏NE水平和肾动脉周围神经TH阳性表达水平升高，表明交感神经活性升高；RDN 治疗后，与T2DM 和Sham 组相比，HR降低、全身及肾脏NE水平和肾动脉周围神经TH阳性表达水平降低，表明RDN可以降低全身及局部交感神经活性。

自噬是真核生物细胞内的循环利用机制，通过形成自噬体结构，可降解或清除细胞中受损或多余的蛋白质和细胞器等成分，维持细胞的平衡。相反，自噬不足或过度会使毒性或受损分子在细胞中积聚，导致与血管内皮功能紊乱相关的疾病。研究表明，糖尿病引起的血管内皮细胞功能障碍与自噬不足密切相关［11］。本研究结果显示，通过高脂饮食联合小剂量STZ诱导的糖尿病大鼠模型血管内皮功能指标vWF 升高，NO 水平降低，表明内皮功能受损严重；血管内皮细胞eNOS 蛋白表达降低，自噬蛋白Beclin1和LC3表达降低，p62表达增加，提示糖尿病大鼠主动脉内皮功能障碍可能与自噬水平受到抑制有关。RDN 干预后能够提高自噬水平并显著改善受损的主动脉内皮功能，表明RDN可能通过激活自噬对糖尿病大鼠主动脉内皮功能发挥保护作用。

NLRP3炎症小体是模式识别受体的一种大分子蛋白复合体，主要由NLRP3 蛋白、凋亡相关斑点蛋白（ASC）和无活性的Caspase-1前体组成，可通过活化Caspase-1调控IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和释放，在炎症反应中起着关键作用。研究发现，NLRP3炎症小体在糖尿病及其所导致的慢性并发症的发生发展过程中起着重要的作用［12］。李红霞等［13］研究发现NLRP3 炎症小体在糖尿病前期高表达，对糖尿病的早期诊断有潜在的价值。另外，活性氧在NLRP3 炎症小体的激活过程中的重要作用受到越来越多关注。Lian 等［14］研究发现，降低活性氧水平可以抑制NLRP3炎症小体的表达，改善内皮细胞的功能。笔者团队前期研究发现，RDN 可能通过降低活性氧及心肌氧化应激水平改善心肌梗死犬的心脏结构和功能［15］。本研究发现，通过高脂饮食联合小剂量STZ 诱导的糖尿病大鼠模型血管内皮NLRP3 mRNA及蛋白表达增高，Caspase-1、IL-1β蛋白表达升高，表明NLRP3炎症复合体在内皮损伤的发生过程中起着重要作用；RDN干预后NLRP3炎症小体水平降低并且受损的主动脉内皮功能明显改善，表明RDN可能通过抑制NLRP3炎症小体的表达对糖尿病大鼠主动脉内皮功能发挥保护作用，分析可能原因是RDN通过降低交感神经活性，降低氧化应激水平，抑制NLRP3炎症复合体的表达。

自噬可以负向调控NLRP3炎症小体的激活，从而抑制机体产生的炎症反应，减轻疾病中产生的炎性损伤。近期Qiao 等［16］研究发现，分子伴侣介导的自噬负向调控NLRP3 炎症小体的活化在动脉粥样硬化抗炎治疗中发挥重要作用。王明霞等［17］研究发现，胡黄连苷Ⅱ可能通过促进巨噬细胞自噬，抑制NLRP3炎症小体的激活，抑制炎症反应。此外，Zhou等［18］发现，小檗碱能够促进巨噬细胞的自噬进而抑制NLRP3 炎症小体活化，以抑制其诱导的炎症反应，改善胰岛素抵抗。本研究发现RDN术后自噬水平升高，同时NLRP3 炎症小体表达水平降低，自噬水平的升高亦有可能负向调控NLRP3 炎症小体的活化。

综上所述，RDN 可以改善T2DM 大鼠的内皮功能障碍，其机制可能与增强血管内皮自噬水平、降低NLPR3炎症小体的表达有关。但由于本研究样本量小，观察时间短，仍需要更多关于RDN、自噬及NLRP3炎症复合体对T2DM血管内皮功能影响的相关研究进一步验证。