七氟烷对海马神经元凋亡相关信号通路影响的研究进展

谢云帆，刘咪，田毅

七氟烷是一种新型的含氟类吸入性麻醉药，目前在临床广泛用于全身麻醉，其血/气分配系数仅为0.69，具有麻醉诱导迅速、苏醒快、可控性良好、对呼吸道无刺激性和独特的芳香气味等优点，成为小儿临床麻醉的理想用药。目前七氟烷对患者行为认知功能的影响成为临床热点之一。有研究表明，低浓度的七氟烷暴露对认知功能有一定的保护作用，这种效应可能与其促进海马神经元生长和改善突触可塑性有关［1］。然而越来越多的实验研究表明，吸入麻醉药可造成神经毒性，导致神经元损伤、凋亡，进而引发认知功能障碍［2］。七氟烷对神经元凋亡的作用机制尚未明确。有研究表明，七氟烷可通过相关信号通路参与神经元凋亡的调节，如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路等［3-4］。对于凋亡相关信号通路的研究，有助于进一步了解七氟烷引起的神经元凋亡及其对认知功能影响的机制。近年来学者对于此类研究集中在海马区域神经元上。本文对七氟烷引起海马神经细胞凋亡中的可能相关信号通路进行综述，旨在为进一步探讨七氟烷影响认知功能的机制提供参考。

1 神经细胞凋亡机制

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，在神经系统的生长发育和老化过程中发挥着重要作用。神经元过度凋亡是人类多种精神疾病的发病机制之一，如神经退行性疾病、脑缺血性损伤等［5］。细胞凋亡途径包括内源性凋亡途径、外源性凋亡途径和内质网途径。内源性途径和外源性途径的共同交叉点是胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的激活，caspase-3 是内源性和外源性途径的最终归路［6］。

1.1 内源性途径 内源性途径又称线粒体途径，是经典的细胞凋亡方式。线粒体凋亡途径可由多种因素诱发，如缺少生长因子和激素、辐射、缺氧和病毒感染等［7］。B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白家族是线粒体膜结构改变的主要调控者［8］，Bcl-2家族蛋白可分为抗凋亡蛋白（如Bcl-2 和Bcl-x）和促凋亡蛋白（如Bax 和Bak）两类，其通过控制线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的开放，进而调节线粒体外膜和内膜的通透性。在凋亡信号的调节下，MPTP 过度开放，线粒体膜电位崩解，导致线粒体外膜断裂，线粒体膜内促凋亡物质［如细胞色素C（Cyt-c）］被释放，Cyt-c可与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合形成复合体，活化caspase-9 前体，从而引发caspase 的级联反应，导致细胞凋亡。因此，各种凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和caspase 相关蛋白是反映细胞凋亡的敏感指标，被广泛应用在神经元凋亡研究中［9］。

1.2 外源性途径 外源性途径又称为细胞凋亡的死亡受体途径，主要是由膜上死亡受体介导的。死亡受体属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族，包括Fas受体（Fas-R）、DR4/DR5、肿瘤坏死因子受体（TNFRs）和TNF 相关的凋亡诱导配体受体（TRAIL-R）等［10］，其中Fas-R和TNFRs 是经典的死亡受体。Fas-R与其配体结合后，与接头蛋白Fas 相关死亡结构域蛋白（FADD）衔接；而TNFRs与TNF结合，随后与TNFRs相关死亡结构域（TRADD）衔接，两者均可促使前caspase-8 的激活并最终导致细胞凋亡。此外，TNF受体与配体结合并衔接TRADD后，还可通过招募肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）及诱导丝/苏氨酸蛋白激酶（RIP）泛素化，使NF-κB 诱导激酶（NFκB-inducingkinase，NIK）活化，NIK 使NF-κB 抑制蛋白发生磷酸化，促进NF-κB的释放，NF-κB移位进入核内激活表达炎性因子（如CXCL2、CCL4），导致细胞凋亡［11］。有研究发现，七氟烷也可能通过NF-κB通路引起炎症反应，从而导致神经元凋亡［12］。

1.3 内质网途径 内质网广泛存在于真核细胞中，参与分泌蛋白的合成、翻译后修饰、正确折叠和钙稳态。各种病理生理条件刺激（包括缺氧、应激、低血糖、缺钙、氧化应激和高脂饮食）均会破坏蛋白质折叠过程，从而导致内质网中未折叠和错误折叠的蛋白质积累，未折叠蛋白反应（UPR）被激活，这种情况称为内质网应激［13］。内质网应激本质上是一种保护性机制，适度的内质网应激通过激活促生存机制，促进细胞脱离危险信号，进入适应性过程，以维持细胞内环境稳态；而长时间、过度的内质网应激通常通过触发多种促凋亡机制［内质网源性转录因子（CHOP）通路、caspase 通路等］，导致细胞凋亡。CHOP 通路是内质网应激诱导细胞凋亡中的主要通路之一［14］。CHOP是促凋亡因子，其不能直接引起细胞凋亡，但可通过调节下游凋亡相关因子Bcl-2 和caspase-12的表达来介导细胞凋亡。以往研究多针对CHOP与细胞凋亡相关的上游调控机制，下游调控机制的相关研究尚少见。CHOP 可抑制抗凋亡信号分子Akt的磷酸化，上调Tribbles同源蛋白3（TRB3）基因的表达，进而依次激活caspase-9和caspase-3。

2 七氟烷与海马神经细胞凋亡相关信号通路的关系

2.1 PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路通过介导生长因子信号在生物生长和关键细胞生理过程中（如葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成和细胞增殖）发挥重要作用［15］。Akt 经PI3K 活化后，可磷酸化其下游的多种底物，产生抗凋亡因子（如Bcl-2、Bcl-xL等），进而发挥脑保护作用。Su等［16］研究结果显示，七氟烷暴露后，海马神经细胞中caspase-3、caspase-9 和Bax 蛋白表达水平升高，Bcl-2 蛋白表达水平降低；而miR-410-3p 可逆转这一作用，并伴随着p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平升高。有研究表明，肿瘤坏死因子相关蛋白3（C1q/tumor necrosis factorrelated protein-3，CTRP3）可通过激活PI3K/Akt 信号通路，减少海马神经元凋亡，在七氟烷诱导的老年大鼠脑损伤中发挥保护作用［17］。但另一项实验研究发现，七氟烷可通过激活PI3K/Akt 信号通路及诱导糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）磷酸化，抑制细胞凋亡和氧化应激，从而改善缺血再灌注引起的神经元损伤［3］。

2.2 NF-κB 信号通路 NF-κB 是一个二聚体转录因子，在协调炎症反应及多细胞生物的细胞分化、增殖和存活中发挥重要作用。大鼠吸入2%七氟烷5 h可通过激活NF-κB 信号通路，促进炎性因子的产生，影响大鼠的学习记忆能力［18］。白细胞介素（IL）-17A 为NF-κB 信号通路中的炎性因子。有研究表明，通过拮抗IL-17A 抑制NF-κB 信号通路，可显著改善老年大鼠的神经炎症和氧化应激，从而缓解七氟烷对老年大鼠认知功能的损害［4］。但魏海婷等［12］研究发现，七氟烷可通过抑制TLR4-NF-κB 信号通路活化，促进海马炎症反应和细胞凋亡，进一步损伤老龄大鼠的认知功能。

2.3 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路 MAPK 是一个重要的、高度保守的、与细胞膜受体和调控靶点相关的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族，可调节细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程［19］。MAPK 包括3 个主要成员：细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、p38 MAPK 和C-jun 氨基末端激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）。

2.3.1 ERK1/2通路 ERK信号通路对神经元生长、存活和可塑性等细胞功能具有重要作用；其在中枢神经系统中被多种分子激活，从而引发各种细胞反应［20］。Wang 等［21］研究显示，七氟烷可通过拮抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体抑制ERK1/2信号通路，上调线粒体中凋亡蛋白caspase-3 和Bax 的表达，导致发育中大脑的海马神经元凋亡。另有研究表明，沉默磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）表达可激活幼年大鼠ERK信号通路，减轻七氟烷诱导的海马细胞氧化应激损伤和细胞凋亡［22］。

2.3.2 P38 MAPK 通路 p38 MAPK 亦被称为应激激活蛋白激酶，其可由一系列细胞毒性应激刺激和细胞因子触发。作为回应，p38 可驱动重要的细胞活动，如细胞增殖、分化、存活及应激诱导的凋亡。在七氟烷处理的新生大鼠中，p38 蛋白表达显著上调，表明p38 MAPK 信号通路被激活［23］。其结果提示七氟烷可能通过激活p38 MAPK 信号通路抑制海马神经元细胞活力，并导致细胞凋亡。

2.3.3 JNK 通路 JNK 通路在将细胞外信号传递到细胞核的过程中发挥重要作用。JNK介导的凋亡信号参与细胞因子的调节、抑制蛋白质合成等。JNK1、JNK2 和JNK3 是脊椎动物中编码JNK 的3 个基因。JNK1和JNK2在人体中广泛表达，而JNK3主要在大脑中表达，其在诱导细胞凋亡中起着关键作用［5］。Bi 等［24］研究发现，七氟烷可通过激活JNK/c-Jun/AP-1信号通路，促进凋亡因子缝隙连接蛋白43（Cx43）表达，导致神经元凋亡，而JNK 抑制剂SP600125可逆转这一作用，并改善发育大鼠七氟烷暴露后的记忆认知功能。

2.4 脑源性神经营养因子/酪氨酸激酶B（brain derived neurotrophic factor/tyrosine kinase receptor B，BDNF/TrkB）信号通路 BDNF是哺乳动物大脑中分布最广泛的营养因子之一，在调节神经元生长、空间学习记忆和突触可塑性等方面发挥着重要作用［25］。Zhang 等［26］研究发现，通过激活BDNF/TrkB 信号通路可降低caspase-3水平，减少海马神经元凋亡。有证据表明，吸入麻醉药暴露引起的认知障碍可能与海马组蛋白乙酰化水平下调密切相关［27］。BDNF/TrkB 对认知功能的影响与其调节神经元生长有着密切关系。Jia 等［28］研究发现，采用3.0%七氟烷/60%氧气混合物麻醉幼鼠，每天2 h，连续3 d，可明显抑制神经干细胞、未成熟神经元和新生神经元的增殖，降低BDNF和TrkB蛋白的表达，而组蛋白乙酰化的非特异性抑制剂NaB 可缓解七氟烷的损害作用，并上调BDNF和TrkB的表达。另有研究表明，上调BDNF表达可减弱七氟烷导致的氧化应激并抑制海马神经元凋亡［29］。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1（activated protein kinase/sirtuin1，AMPK/SIRT1）信号通路 AMPK由1个催化亚单位（α）和2个调节亚单位（β 和γ）组成，是关键的调节因子，其通过调控各种调节信号通路在细胞水平上维持能量代谢的稳定性。SIRT1 是一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NAD+）依赖性蛋白脱乙酰酶，通过细胞内信号因子的脱乙酰化，在调节细胞凋亡、代谢和分化等生理和病理过程中发挥重要作用［30］。激活AMPK-SIRT1-PGC-1α途径可以对抗氧化应激及维持线粒体功能，减轻七氟烷对大鼠的海马神经元损伤［31］，CTRP3 可通过激活AMPK/SIRT1和信号通路抑制七氟烷麻醉诱导的老龄大鼠海马神经元凋亡［17］。Liu 等［32］研究也为AMPK激活可以改善七氟烷诱导的认知障碍提供了证据。AMPK/SIRT1 通路可能是未来治疗七氟烷所致认知功能障碍的潜在药物靶点。

3 药物对于七氟烷致神经元凋亡的预防与治疗

有学者也在不断探究减轻七氟烷麻醉诱导的神经毒性的干预措施，其中抑制海马神经元凋亡是重要一环。细胞凋亡需要经过一系列复杂的信号转导过程，在其中任何环节上加以阻断均可实现抑制细胞凋亡的目的。Yang等［33］研究表明，三七总皂苷可通过激活PI3K/Akt 信号通路，有效地保护神经元免受七氟烷诱导的细胞毒性。另有研究表明，叶黄素可通过介导NF-кB/NLRP3通路抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，从而对七氟烷引起的空间学习记忆损伤发挥保护作用［34］。康文越等［35］研究发现，日龄7 d的大鼠行吸入2%七氟烷麻醉，在麻醉4 h前给予右美托咪定后大鼠海马CA1区凋亡细胞数较未给药组明显减少，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，其机制可能为右美托咪定可通过抑制p38 MAPK通路减少细胞凋亡，从而缓解大鼠七氟烷麻醉后的认知损害。有实验研究发现，经典的降糖药二甲双胍也可保护神经元免受七氟烷诱导的损伤，可能与鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1P1）依赖的ERK1/2信号通路有关［36］。值得注意的是，在研究阻断信号通路来抑制神经元凋亡的同时，也应考虑这些通路在对其他非凋亡功能方面的影响［6］。

4 小结

神经元凋亡涉及多个途径，调控凋亡的信号通路也十分复杂，通路之间又相互关联［15］，这对研究相关机制的科研工作者来说是不小的挑战。目前关于七氟烷导致神经元凋亡的研究主要集中在海马相关区域，而其他学习、记忆相关的前额叶、杏仁核、间脑、小脑及Meynert基底核等研究尚少见。在凋亡机制方面，绝大多数是针对Bcl-2 蛋白家族和caspase途径的研究，而死亡受体途径和内质网应激途径相关资料较为缺乏。本研究仅就七氟烷引起海马神经元凋亡研究较多的信号通路进行概括，更多的信号通路及其具体机制有待进一步探究。