Notch3调控Hes2逆转三阴性乳腺癌上皮-间质转化的机制研究

田园，牟雅君，杨文秀，豆晓伟

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型［1］。由于TNBC缺乏特异性治疗靶点，目前尚无分子靶向药物用于治 疗 TNBC。上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是癌症转移的关键步骤，TNBC 具有较强的EMT 特征［2-3］。有研究报道，Notch3 缺失是TNBC 的一个重要特征，Notch3 可通过激活乳腺癌上皮细胞中Hippo/Yes 相关蛋白（YAP）通路来抑制EMT［4］。另有研究表明，过表达Notch3可抑制TNBC细胞增殖［5］；高表达Notch3可以增加TNBC 细胞MDA-MB-231 对顺铂的敏感性，且高表达Notch3 的乳腺癌患者总生存期高于Notch3低表达患者［6］。因此，Notch3可视为TNBC的抑制因子，但其作用机制尚未明确。作为Notch信号通路的下游靶基因，Hes 家族基因在癌症发生过程中起着重要作用［7-8］。Hes 家族包括Hes1～7 共7 个蛋白。据报道，Hes1在TNBC 中过度表达并促进了侵袭［9］；降低Notch1 的激活和下游靶蛋白Hes1 的表达可抑制TNBC 干细胞增殖［10］。本课题组前期研究显示，上调TNBC 细胞MDA-MB-231 中Notch3 后，Hes1 表达并未增高，而Hes2 表达明显升高。因此，笔者拟通过本研究验证Notch3能否逆转TNBC的EMT及抑制肿瘤转移，以及此过程是否与上调Hes2 表达有关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 TNBC 细胞系MDA-MB-231（货号SCDP-197）购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM培养基（货号11965092）、胎牛血清（货号10099141C）、Lipofectamine 3000转染试剂（货号L3000-015）、Trizol试剂（货号15596018）、BCA蛋白质定量试剂盒（货号361977）均购自美国Invitrogen 公司；Notch3 过表达质粒（pcDNA3.1-Notch3-GFP）及其阴性对照质粒（pcDNA3.1-NC-GFP）、Hes2 敲低的小分子干扰质粒（si-Hes2-GFP）及其阴性对照质粒（si-NC-GFP）均由深圳华大基因有限公司合成；逆转录试剂盒（货号RL019A）、PCR试剂盒（货号RR820A）、细胞计数试剂盒-8（CCK-8，货号RK035L）均购自日本TaKaRa 公司；Transwell 小室（货号3422）购自美国Corning 公司；鼠抗人Notch3（货号sc-515825）、Hes2（货号sc-166705）单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；鼠抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin，货号A3044）、波形蛋白（Vimentin，货号A19607）、β-肌动蛋白（β-actin，货 号A10752）单克隆抗体及鼠抗人二抗（货号A06631）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；CO2细胞培养箱（型号HERAcell 240i）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；实时荧光定量PCR（qPCR）仪（型号7500）、凝胶成像系统（型号Healthcare）均购自美国应用生物系统公司；多功能酶标仪（型号iMark680）购自美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜（型号IX73）购自日本Olympus公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231 细胞培养使用DMEM 培养基（含10%胎牛血清以及100 U/mL 青霉素和100 mg/L 链霉素），在37 ℃和5%CO2细胞培养箱中进行培养。待细胞融合度为80%～90%时进行传代。

1.2.2 细胞转染 将对数生长期的MDA-MB-231 细胞（5×104个/mL）接种于6 孔板中，每孔2 mL，培养过夜；待细胞融合度为60%～80%时，采用Lipofectamine 3000试剂进行转染实验，细胞分为：对照组（不进行任何转染）、pc-NC 组（转染pcDNA3.1-NC-GFP）、Notch3 过表达组（pc-Notch3 组，转染pcDNA3.1-Notch3-GFP）、Notch3 过表达+si-NC 组（pc-Notch3+si-NC 组，共转染pcDNA3.1-Notch3-GFP 和si-NCGFP）、Notch3过表达+Hes2敲低组（pc-Notch3+si-Hes2组，共转染pcDNA3.1-Notch3-GFP 和si-Hes2-GFP）。收集转染细胞用于后续实验。

1.2.3 qPCR 检 测MDA-MB-231细胞中Notch3、Hes2 的mRNA 表达 转染后48 h，用Trizol 试剂从MDA-MB-231 细胞提取总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA（1 μg）逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，采用qPCR 扩增目的基因Notch3、Hes2。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法评估目的基因的相对表达水平。β-actin作为内参基因。引物序列见表1。实验重复3次。

1.2.4 CCK-8 法检测细胞增殖活性 将转染的MDA-MB-231细胞以1 000个/孔接种于96孔板，根据CCK-8试剂盒说明书评估细胞增殖活性。在转染0、24、48、72 h时每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育2 h 后，在450 nm波长处定量吸光度（A450）值。实验重复3次。

1.2.5 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 将转染的MDA-MB-231细胞以2×105个/孔的密度接种在6孔板中，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育细胞。当细胞密度达到90%～95%时使用移液器吸头进行划痕，用PBS洗涤细胞，并用含有2%胎牛血清的DMEM 培养基培养细胞。于0 h、48 h 后用光学显微镜观察划痕愈合情况。通过测量细胞划痕宽度计算细胞迁移率，迁移率（%）=（0 h划痕宽度-48 h细胞划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

Tab.1 The primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 将5×104个转染的MDA-MB-231 细胞接种于Transwell 上室，无血清培养基孵育，同时将600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养基加到下室。培养48 h 后，将移至Transwell 下室的细胞用4%多聚甲醛固定，0.05%结晶紫染色。在光学显微镜下收集代表性图像，并计数穿膜细胞数。实验重复3次。

1.2.7 Western blot 检测细胞Notch3、Hes2 和EMT 相关蛋白表达 将转染的MDA-MB-231 细胞以2×105个/孔的密度接种在6孔板中，实验设置3个复孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育细胞。当细胞密度达到80%时，用RIPA 裂解缓冲液提取MDA-MB-231 细胞中的总蛋白质，并通过BCA 蛋白质定量试剂盒测量浓度。将30 μg 总蛋白质进行凝胶电泳分离，并将凝胶中分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜。转移后，将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，与鼠抗人Notch3（1∶500）、Hes2（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）一抗在4 ℃下孵育过夜。然后将膜洗涤后与鼠抗人二抗（1∶4 000）在室温下孵育1 h。增强化学发光底物显色，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析膜上蛋白质条带灰度，并以β-actin 为内参，计算目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；不同时间点多组间比较采用重复测量设计的方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MDA-MB-231 细胞Notch3、Hes2 mRNA和蛋白表达水平比较 对照组和pc-NC 组Notch3、Hes2 的mRNA 和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组和pc-NC 组比较，pc-Notch3组、pc-Notch3+si-NC组和pc-Notch3+si-Hes2 组Notch3 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组Hes2 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与pc-Notch3组和pc-Notch3+si-NC 组比较，pc-Notch3+si-Hes2 组Hes2 的mRNA 和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。pc-Notch3 组、pc-Notch3+si-NC 组、pc-Notch3+si-Hes2组Notch3的mRNA 和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。pc-Notch3 组、pc-Notch3+si-NC 组Hes2 的mRNA 和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

Fig.1 Western blot assay of Notch3 and Hes2 of MDA-MB-231 cells in each group图1 各组MDA-MB-231细胞Notch3、Hes2蛋白印迹图

Tab.2 Comparison of Notch3,Hes2 mRNA and protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表2 各组MDA-MB-231细胞Notch3、Hes2的mRNA和蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of Notch3,Hes2 mRNA and protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表2 各组MDA-MB-231细胞Notch3、Hes2的mRNA和蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与pc-NC组比较，c与pc-Notch3组比较，d与pc-Notch3+si-NC组比较，P＜0.05。

2.2 各组MDA-MB-231细胞增殖活性比较 在0～72 h 时，各组细胞增殖活性随时间的增加而升高（P＜0.05）。转染0 h、24 h 时，各组间细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）；转染48 h、72 h 时，对照组和pc-NC 组细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组和pc-NC组比较，pc-Notch3组和pc-Notch3+si-NC 组细胞增殖活性显著降低（P＜0.05）；与pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组比较，pc-Notch3+si-Hes2 组细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.3 各组MDA-MB-231 细胞迁移能力比较 对照组和pc-NC 组细胞迁移率差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组和pc-NC 组比较，pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组细胞迁移率显著降低（P＜0.05）；与pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组比较，pc-Notch3+si-Hes2 组细胞迁移率显著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组细胞迁移率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表4。

2.4 各组MDA-MB-231 细胞侵袭能力比较 对照组和pc-NC 组穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组和pc-NC 组比较，pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组穿膜细胞数显著降低（P＜0.05）；与pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组比较，pc-Notch3+si-Hes2 组穿膜细胞数显著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表4。

2.5 各组MDA-MB-231细胞EMT 相关蛋白表达水平比较 对照组和pc-NC组E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组和pc-NC 组比较，pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组E-cadherin 蛋白表达水平显著升高，Vimentin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC 组比较，pc-Notch3+si-Hes2 组E-cadherin蛋白表达水平显著降低，Vimentin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。pc-Notch3 组和pc-Notch3+si-NC组E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、表5。

3 讨论

TNBC 的复发率和转移潜力均高于其他乳腺癌亚型［11］。由于TNBC 的内在复杂性，以及缺乏特异性的治疗靶点和预后监测指标，往往预后较差［12］。因此，有必要寻找新的治疗靶点。

Tab.3 Comparison of proliferative activity of MDA-MB-231 cells between the five groups表3 各组MDA-MB-231细胞增殖活性比较 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of proliferative activity of MDA-MB-231 cells between the five groups表3 各组MDA-MB-231细胞增殖活性比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；组间比较：a与对照组比较，b与pc-NC组比较，c与pc-Notch3组比较，d与pc-Notch3+si-NC组比较，P＜0.05；组内比较：A与0 h比较，B与24 h比较，C与48 h比较，P＜0.05。

Fig.2 Changes of migration ability of MDA-MB-231 cells in each group(×100)图2 各组MDA-MB-231细胞迁移能力变化（×100）

Fig.3 Comparison of invasive ability of MDA-MB-231 cells between the five groups(Crystal violet staining,×200)图3 各组MDA-MB-231细胞侵袭能力比较（结晶紫染色，×200）

Tab.4 Comparison of MDA-MB-231 cell migration rate and number of transmembrane cells between the five groups表4 各组MDA-MB-231细胞迁移率和穿膜细胞数比较 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of MDA-MB-231 cell migration rate and number of transmembrane cells between the five groups表4 各组MDA-MB-231细胞迁移率和穿膜细胞数比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与pc-NC组比较，c与pc-Notch3组比较，d与pc-Notch3+si-NC组比较，P＜0.05。

Fig.4 Western blot assay of E-cadherin and Vimentin of MDA-MB-231 cells in each group图4 各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、Vimentin蛋白印迹图

Tab.5 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表5 各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、Vimentin蛋白水平比较 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein levels of MDA-MB-231 cells between the five groups表5 各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、Vimentin蛋白水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与pc-NC组比较，c与pc-Notch3组比较，d与pc-Notch3+si-NC组比较，P＜0.05。

Notch 家族包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，在肿瘤发生过程中，其具有不同的活性和生物学功能；其中Notch3 在乳腺癌（如TNBC）转移中发挥关键作用［13］。EMT 是上皮细胞的一种特征性转化，被认为是癌症转移的驱动力，其特征是上皮标志物Ecadherin 的丢失和间充质标志物Vimentin 的过表达［14］。目前，关于Notch3在乳腺癌EMT中的作用存在争议［15］。第1 种观点认为，Notch3 通过诱导EMT促进肿瘤侵袭性，乳腺癌细胞中Notch3 表达下调可显著抑制EMT，降低乳腺癌发生骨转移的风险［16］。第2种观点认为，在乳腺癌患者中，Notch3表达上调与低淋巴结转移率相关，Notch3 可通过激活GATA结合蛋白3转录抑制EMT及乳腺癌转移［17］；且Notch3 在体外可通过肾脏脑蛋白介导的Hippo/YAP信号通路负调节EMT［4］。本研究结果支持第2 种观点，Notch3 诱导EMT 促进肿瘤侵袭的研究结论不一，推测可能与Notch3下游基因的激活有关，不同下游基因的激活可能导致Notch3在乳腺癌中发挥不同作用。这些研究表明Notch3信号通过激活新的下游基因来抑制乳腺癌细胞发生EMT。因此，探究Notch3 抑制TNBC 转移的分子机制有助于寻找TNBC治疗新靶点。

Hes 家族基因是公认的Notch 信号通路的下游靶基因［18］。研究显示，Hes2在卵巢癌中表达水平升高与卵巢癌细胞的增殖活力和迁移能力有关［19］，且参与食管癌［20］等侵袭性肿瘤的进展。但已有的研究并未发现Hes2 的相关机制，且关于Hes2 对乳腺癌的影响罕见报道。本研究结果显示，过表达Notch3后，MDA-MB-231细胞中Hes2的mRNA和蛋白水平显著高于对照组，且MDA-MB-231 细胞的增殖活性、迁移与侵袭能力均降低，同时E-cadherin蛋白表达水平升高，Vimentin蛋白表达水平降低，提示EMT受到抑制，Notch3 可能通过Hes2 在逆转MDA-MB-231细胞EMT中发挥作用。

为验证以上推测，本研究在过表达Notch3 的MDA-MB-231 细胞中，采用小分子干扰技术敲低Hes2 表达，进行CCK-8 测定、划痕愈合测定和Transwell 小室测定以探索表型变化。结果显示，在TNBC 细胞系MDA-MB-231 中，Vimentin 蛋白表达水平升高，E-cadherin 蛋白表达水平降低，并导致Notch3 过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用被显著减弱，提示敲低Hes2 表达可促进EMT，过表达Notch3 可能通过上调Hes2 来逆转TNBC 的EMT，抑制肿瘤转移。

综上所述，Notch3 对TNBC 转移和EMT 的抑制作用可能与Hes2 表达水平升高有关。本研究为TNBC 提供了一个潜在的治疗靶标，但目前Notch-Hes 信号通路对乳腺癌影响的研究尚不全面，其在肿瘤中的功能和调控机制仍需进一步明确。此外，Notch3 在TNBC 中的作用还需通过体内研究进一步验证，这也将是今后的研究重点。