Nrf2-GPX4介导的铁死亡通路参与右美托咪定对脑出血大鼠神经保护作用的机制研究

李秋畅，闫顺昌，蒙亚珍，顾云霞，宁巧明，李娜，王志华

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种具有高病死率的脑卒中亚型，老年患者居多，目前仍缺乏有效治疗方法［1］。研究发现，当ICH发生时，铁会在血肿周围积累，而过量的铁积累可造成氧化应激，损伤细胞膜、蛋白质及DNA，从而对细胞功能造成严重破坏，导致神经细胞死亡［2-3］。降低ICH后铁积累造成的铁死亡发生，对ICH 的治疗至关重要。目前针对该方面的药物研究十分有限。核因子E2相关因子2/谷胱甘肽过氧化物酶4（nuclear factor erythroid-2 related factor 2/glutathione peroxidase 4，Nrf2/GPX4）是一个与铁死亡相关的抗氧化途径。研究表明，激活该途径可减少铁积累，从而缓解脑损伤后铁死亡造成的神经损伤［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）为临床实践中常用麻醉辅助剂，是α2肾上腺素能受体激动剂，具有高度特异性，可作用于蓝斑从而产生抗焦虑、镇静的作用，在ICH时可以进行神经保护［5-6］。但其对ICH 的神经保护作用是否与铁死亡有关还不清楚。本研究通过构建ICH 大鼠模型，基于Nrf2-GPX4 介导的铁死亡通路探究Dex 对ICH 大鼠的神经保护作用，以期为针对ICH铁死亡相关新药的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠100 只，体质量190～230 g，40～45日龄，购自中国医学科学院医学生物学研究所。大鼠恒温饲养7 d，以适应环境（12 h昼夜交替），饲养期间自由进食及饮水，许可证号：SCXK（滇）K2019-0002。

1.2 试剂和仪器 右美托咪定（国药准字H20133331，1 mL∶0.1 mg，江苏恩华药业）；ML385（CSN22320-5 mg，CSNpharm，Inc.）；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、铁离子、谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（E2019、E1042-100/300、E2015，北京普利莱）；HE 染色试剂盒（DH0006，北京雷根生物）；BCA 试剂盒（LCB004，上海榕柏生物）；兔抗Nrf2、βactin、GPX4、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（Cystine/glutamate antiporter system light chain，xCT）抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（SA00001-2、16396-1-AP、60008-1-Ig、14432-1-AP、26864-1-AP、SA00001-2，Proteintech）；Nissl 染色液（KGMP0185，江苏凯基生物）；普鲁士蓝染色试剂盒（SOS-939，北京凯诗源生物）；UVP Gelstudio PLUS touch凝胶成像仪（德国耶拿）；JC-1086A酶标仪（青岛聚创环保集团）；Talos F200C TEM透射电子显微镜（北京欧波同光学技术）。

1.3 研究方法

1.3.1 分组和ICH 模型建立 采用随机数字表法将大鼠分成Sham组、ICH组（模型组）、Dex-L组（Dex 50 μg/kg）、Dex-H组（Dex 100 μg/kg）［7］和Dex-H+ML385组（Nrf2抑制剂ML385 30 mg/kg）［8］，每组20只。除Sham组外，其余组通过自体血注射法进行ICH 模型建立：大鼠腹腔注射3 mL/kg 水合氯醛（10%）进行麻醉后俯卧位固定，消毒后于前囟旁（3 mm）纵向开口（10 mm），切开头皮暴露前囟，于前囟后方1 mm、侧方3 mm 处钻孔，于右侧尾状核处注入50 μL 自体尾静脉血（10 min 内）后留针5 min，退针、缝合开口，Sham 组于相同位置注入生理盐水（50 μL）［9］，2 h后若Zea Longa 评分为1～3分则造模成功［10］。Dex-L 组、Dex-H 组、Dex-H+ML385 组于术前30 min腹腔注射相应Dex或ML385，Sham组和ICH组则注射等量的生理盐水。

1.3.2 神经功能缺损评分 于术后2 h 使用Zea Longa 评分法评定大鼠神经功能：无神经损伤记0分；对侧前爪无法伸直记1分；对侧转圈记2分；对侧倾倒记3分；自发行走障碍或者意识丧失记4分［9］。

1.3.3 GSH、MDA、铁离子含量检测 术后24 h，每组随机抽取5只大鼠进行颈椎脱臼处死，断头取出脑组织后分离血肿周围脑组织并置于研钵中进行匀浆、离心。通过比色法对一部分上清液进行GSH、MDA、铁离子含量的测定，其余部分用于Western blot。

1.3.4 大鼠血肿周围脑含水量检测 每组另随机抽取5只大鼠大脑血肿周围组织称质量，60 ℃烘烤48 h，于脑质量恒定后称取干质量，脑组织含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%，重复5次。

1.3.5 HE染色对血肿周围脑组织进行病理学检测 每组再次随机抽取5只大鼠，取其脑组织，一部分使用多聚甲醛浸泡将其固定，脱水、石蜡包埋并切片（4 μm），行HE染色后光镜检测脑组织病理学；另一部分行Nissl染色。

1.3.6 Nissl 染色观察大鼠血肿周围脑组织神经细胞损伤情况 将1.3.5所余另一部分脑组织进行冷冻后制作冰冻切片（5 μm），经过二甲苯脱蜡后使用无水乙醇脱水，滴加焦油紫溶液（0.1%）染色及盐酸-乙醇分色后依次进行脱水、透明和封片，于400 倍显微镜下随机读取血肿周围大脑皮层5 个视野观察神经细胞数量（n=5）。

1.3.7 普鲁士蓝染色检测血肿周围脑组织中铁沉积 取每组剩余的5 只大鼠脑组织制成常规切片，进行60 s 的蒸馏水冲洗，Perls 染色40 min 后再次冲洗，核固红试剂核染10 min后脱水透明、封片并风干，于光镜下观察蓝色铁沉积。

1.3.8 Western blot 检测脑组织GPX4、xCT、Nrf2 表达取1.3.3剩余上清液蛋白，BCA法对其定量，蛋白上样进行SDSPAGE 电泳，将蛋白转移到PVDF 膜后脱脂牛奶（5%）进行封闭，过夜（4 ℃）孵育GPX4、xCT、Nrf2、β-actin抗体（1∶1 000），次日孵育HRP-IgG二抗（1∶2 000），120 min后ECL显色曝光，Image Lab软件分析计算GPX4、xCT、Nrf2的相对表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 7 软件进行数据分析。计量资料以±s表示，多组比较行one-way ANOVA 检验，组间多重比较行LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 Sham 组、ICH 组、Dex-L 组、Dex-H 组、Dex-H+ML385 组神经功能缺损评分分别为（0.00±0.00）、（2.54±0.46）、（1.30±0.29）、（0.44±0.07）、（1.64±0.41）分，组间比较差异有统计学意义（F=214.184，P＜0.01）；相较于Sham 组，ICH 组明显增加；相较于ICH 组，Dex-L 组与Dex-H 组依次明显降低；相较于Dex-H 组，Dex-H+ML385组明显增加（均P＜0.05）。

2.2 各组大鼠脑组织GSH、MDA、铁离子含量比较 相较于Sham组，ICH组MDA、铁离子含量增加，GSH含量减少；相较于ICH组，Dex-L组与Dex-H组MDA、铁离子含量依次减少，GSH 含量增加；相较于Dex-H组，Dex-H+ML385组MDA、铁离子含量增加，GSH含量减少（均P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各组大鼠脑组织铁离子、MDA、GSH含量比较 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各组大鼠脑组织铁离子、MDA、GSH含量比较 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham 组比较，b与ICH 组比较，c与Dex-L 组比较，d与Dex-H组比较，P＜0.05；表2同。

2.3 各组大鼠血肿周围脑组织含水量比较 Sham组、ICH组、Dex-L组、Dex-H组、Dex-H+ML385组脑含水量分别为（61.82±6.95）%、（87.22±7.83）%、（76.04±6.01）%、（63.10±6.12）%、（81.09±6.94）%，组间比较差异有统计学意义（F=13.406，P＜0.05）；相比Sham 组，ICH 组的脑含水量明显增加；相比ICH组，Dex-L组与Dex-H组的脑含水量明显减少；相比Dex-H 组，Dex-H+ML385 组的脑含水量明显增加（均P＜0.05）。

2.4 各组大鼠脑组织病理情况变化 Sham 组脑组织结构未见异常；ICH组血肿周围脑组织炎性浸润、坏死及水肿现象严重，神经细胞呈疏松且不规则排列；相比ICH 组，Dex-L 组与Dex-H 组的细胞水肿、坏死及炎性浸润现象明显减轻，细胞间隙减小；相比Dex-H 组，Dex-H+ML385组上述损伤现象进一步加重，见图1。

2.5 各组大鼠脑组织神经细胞损伤情况比较 Sham组神经细胞形态正常且结构完整，存在大量尼氏体，未发现异常现象；ICH 组神经细胞稀疏、紊乱，坏死严重，尼氏体数量明显减少；相比ICH 组，Dex-L 组与Dex-H 组的神经细胞层次丰富、紧密排列且坏死减少，尼氏体增多；相比Dex-H组，Dex-H+ML385组神经细胞损伤明显加重，见图2。Sham 组、ICH 组、Dex-L组、Dex-H组、Dex-H+ML385组神经细胞数分别 为（92.46±5.92）、（20.46±4.20）、（38.79±5.05）、（62.35±5.47）、（35.67±4.53）个/视野，组间比较差异有统计学意义（F=153.491，P＜0.01）；相比Sham 组，脑组织神经细胞数在ICH组明显减少；相比ICH组，Dex-L 组与Dex-H 组的神经细胞数依次明显增加；相比Dex-H组，Dex-H+ML385组的神经细胞数明显减少（均P＜0.05），见图2。

2.6 各组大鼠脑组织铁沉积比较 Sham 组脑组织中未观察到铁沉积现象；相比Sham 组，ICH 组铁沉积增多；相比ICH组，Dex-L组与Dex-H组铁沉积依次减少；相比Dex-H 组，Dex-H+ML385 组铁沉积增多，见图3。

2.7 各组大鼠脑组织GPX4、xCT、Nrf2 蛋白表达水平比较 相比Sham 组，ICH 组的GPX4、xCT、Nrf2 表达水平降低；相比ICH 组，Dex-L 组与Dex-H 组的GPX4、xCT、Nrf2表达水平依次升高；相比Dex-H组，Dex-H+ML385组GPX4、xCT、Nrf2表达水平降低（均P＜0.05），见表2、图4。

3 讨论

ICH 属于脑卒中急性亚型，约占出血性卒中的80%；导致ICH 患者预后不良的是神经细胞损伤的复杂病理过程，而铁积累则被证明是导致脑水肿及神经细胞发生不可逆损伤的主要原因之一，因此抑制铁死亡可保护神经细胞［11-12］。然而，ICH 后铁死亡发生的具体机制尚未阐明。

Fig.1 Pathological changes of brain tissue in each group(HE staining,×400)图1 各组大鼠脑组织病理情况变化（HE染色，×400）

Fig.2 Comparison of nerve cell damage in brain tissue of rats between the five groups (Nissl staining,×400)图2 各组大鼠脑组织神经细胞损伤情况比较（Nissl染色，×400）

Fig.3 Comparison of iron deposition in brain tissue of rats between the five groups (Prussian blue staining,×400)图3 各组大鼠脑组织铁沉积比较（普鲁士蓝染色，×400）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各组大鼠脑组织GPX4、xCT、Nrf2表达水平比较 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各组大鼠脑组织GPX4、xCT、Nrf2表达水平比较 （n=5，±s）

Fig.4 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups图4 各组大鼠脑组织GPX4、xCT、Nrf2蛋白表达水平比较

α2 肾上腺素受体激动剂Dex 是一种具有催眠、镇静作用的咪唑衍生物，α2肾上腺素受体广泛分布于周围神经系统、中枢神经系统及自主神经节中。大量证据表明，Dex可以通过抗氧化、抑制细胞凋亡或影响细胞信号通路等多种机制对神经起保护作用，也对ICH、脑缺血再灌注损伤等具有显著的改善作用［7，13］。Dex 可通过抑制炎症小体的激活来减轻脑组织炎症损伤，保护ICH 后血脑屏障［14］。Dex 在ICH小鼠中可通过抑制由线粒体功能障碍造成的氧化应激来改善神经功能缺损［6］。Dex在SK-N-SH神经细胞中可通过抑制叔丁基氢过氧化物诱导的铁积累来改善细胞氧化损伤［15］。另有研究发现，100 μg/kg Dex对脑缺血再灌注大鼠神经功能具有明显的保护作用［7］。因此，本研究使用50、100 μg/kg Dex 处理ICH大鼠，发现Dex可显著降低ICH大鼠神经功能缺损评分、MDA、铁离子含量、脑含水量、脑组织病理损伤、铁沉积，增加GSH 含量、神经细胞数，其改善程度随Dex 含量的升高而更为显著。该结果表明，Dex 具有抑制ICH 大鼠脑组织氧化损伤及铁积累，改善神经功能的作用。

内源性抗氧化酶GPX4 可使脂质过氧化物转化为无毒的脂质，以此起到抵抗脂质过氧化的作用，从而抑制铁死亡；GSH作为合成GPX4所必要的底物，起到辅助GPX4 发挥抗氧化功能的作用，已被认为是调节铁死亡的关键因子［11，16］。研究发现，Nrf2 可通过促进xCT、GSH 及GPX4 表达来抵抗铁死亡［17］。在非压力条件下，Nrf2 主要与Kelch 样ECH 相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）相结合，当氧化应激发生时，Keap1被降解后与Nrf2分离，后者进入胞核中启动抗氧化基因转录［17-18］。Nrf2-Keap1蛋白复合物由于可调节细胞抗氧化反应并减轻氧化应激，调节脂质代谢和铁/血红素代谢，因此可作为铁死亡抑制剂［17，19］。GPX4 通过介导铁死亡来促进ICH 后继发性脑损伤，而抑制铁死亡或GPX4 表达可改善ICH 造成的脑损伤［20］。本研究发现，Dex 可显著增加ICH 大鼠GPX4、xCT、Nrf2 表达水平，并在ICH 大鼠中可有效激活Nrf2-GPX4 信号通路。本研究还显示，Nrf2 抑制剂ML385 可逆转Dex 对ICH 大鼠脑组织氧化损伤及铁积累的抑制，以及对神经功能的改善。因此，本研究不仅为ICH后铁死亡机制的研究提供参考，对于相应药物的开发也具有重要意义。但本研究仅限于体内，今后尚需进行体外研究以丰富研究内容。