有机硒化合物乙烷硒啉抑制腺样囊性癌细胞生长的体外研究

邢凤霞，张 强，卢国徽，赵艳芳，周 琼

（北京大学第三医院北方院区口腔科，北京 100089）

硒是一种人体必需的微量元素，在机体内发挥着多种生理功能，比如抗氧化损伤、解毒、增强免疫力等。流行病学研究提示，血清硒浓度与肿瘤发生率、死亡率之间呈负相关[1]。因此人们设计合成了多种含硒化合物抑制肿瘤[2]。但是这些含硒化合物的毒副作用也限制了其在肿瘤治疗中的应用[3]。因此，北京大学药学院师长进等[4]合成了一种高效、低毒的有机硒化合物-乙烷硒啉（1,2-[ 二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]乙烷，BBSKE）。体外研究显示，BBSKE对多种肿瘤细胞，如肝癌Bel-7402、白血病HL-60、鼻咽癌KB、宫颈癌HeLa、胃癌BGC-823等细胞系有明显抑制作用；动物实验表明，BBSKE明显抑制肺癌、前列腺癌等的生长[5-6]。腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，易沿神经扩散，浸润性极强，肺转移率高。虽然可长期带瘤生存，但其远处转移和复发率较高，且对多种化疗药物均不敏感。基于此，本研究探讨BBSKE对腺样囊性癌细胞生长的抑制作用及机制，将有助于腺样囊性癌的辅助治疗。

1 材料与方法

1.1 试剂 乙烷硒啉(北京大学有机硒药物研究中心，分子量422.2，含量＞98.5%)，用二甲基亚砜（DMSO）（上海吉至生化科技有限公司）制成20 mmol/L储存液，20 ℃分装保存。3(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）；无血清细胞冻存培养基（RPMI 1640）（GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）；[5,5－二硫双（2－硝基苯甲酸）](DTNB)和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）购自Sigma公司。本实验经北京大学第三医院医学伦理委员会批准。

1.2 细胞培养 人腺样囊性癌细胞系（SACC-83、SACC-LM）由本实验室建系。细胞用含15%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液；于37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养。

1.3 细胞增殖分析 用MTT法[7]观察BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞增殖活性的影响。对数生长期SACC-83、SACC-LM制备细胞悬液，按5×103个/孔，180 μL/孔，接种于96孔板。24 h后吸取上清液，更换为含不同浓度BBSKE的细胞培养液，阴性对照组含0.1%的DMSO，每一浓度设置6个复孔，继续培养24、48、72 h。培养结束前每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h，吸尽培养液后每孔加入150 μL DMSO，37 ℃，100 r/min震荡10 min，充分溶解结晶后用酶标仪 (USA，型号：BIO-Tek Elx808)于570 nm波长下测每孔的吸光度（A值）。计算细胞存活率[细胞存活率=加药组平均A值/对照组平均A值）×100%]及抑制肿瘤细胞生长达到50%时的药物浓度（IC50）。以上实验重复至少3次。

1.4 赫斯特（Hoechst）荧光染色 用Hoechst荧光染色法[8]观察BBSKE对SACC-83、SACCLM细胞形态变化的影响。对数生长期SACC-83、SACC-LM制备细胞悬液，按2.5×105个/孔接种于D60 mm的培养皿。24 h后吸去上清液，更换为含10 μmol/L BBSKE的细胞培养液，阴性对照组含0.1%的DMSO，每一浓度设置3个复孔，继续培养24 h。之后用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，采用Hoechst染色，荧光显微镜(200倍)观察细胞形态变化。

1.5 半胱氨蛋白水解酶-3（Caspase-3）活性检测 SACC-83、SACC-LM细胞经不同浓度的BBSKE处理48 h后，按Caspase-3活性检测试剂盒（Promega公司）说明，加入细胞裂解液1×108个细胞/mL提取蛋白，Brandford法定量（普利莱公司）。50 μg蛋白加入2 μL底物，37 ℃孵育4 h后在酶标仪405 nm波长处检测吸光度值。以上实验重复2次，取平均值进行统计学计算。

1.6 硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测 采用DTNB法 测 定 TrxR 活 性[9]。SACC-83、SACCLM细胞经不同浓度的BBSKE（每个浓度2个平行样）处理48 h后加入蛋白裂解液 [25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl） (pH=7.4)，137 mmol/L 氯化钠，1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），1% 脱氧胆酸钠，10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）]提取蛋白，Brandford法蛋白定量后，在半微量比色池中加入0.3 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、10 μg细胞蛋白，用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液调节最终体积至100 μL[DTNB的体积]。加入150 μmol/L DTNB启动DTNB二硫键还原反应，立即在核酸/蛋白检测仪（Beckman Coulter DU730）412 nm处测定吸光度值，每10 s测定1次，连续测定10 min，记录吸光度值的变化量。

1.7 统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BBSKE对腺样囊性癌细胞系SACC-83、SACC-LM细胞增殖的抑制作用 MTT实验结果显示，BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞的增殖均有抑制作用。不同浓度的BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。BBSKE作用于SACC-83和SACC-LM腺样囊性癌细胞 72 h，IC50分别为 12 μmol/L 和 10 μmol/L，见图1。

图1 BBSKE对腺样囊性癌细胞系SACC-83、SACC-LM细胞增殖的抑制作用

2.2 BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞形态变化的影响 细胞凋亡的特征性形态学变化主要包括细胞皱缩、染色质凝集、凋亡小体形成。10 μmol/L的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM细胞24 h，细胞均出现细胞凋亡相应形态变化，结果显示，BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞均有凋亡诱导作用，且SACC-LM细胞凋亡发生更为敏感，见图2。

图2 BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞形态变化的影响

2.3 不同浓度BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞中Caspase-3活性的影响 以0 μmol/L为对照，采用3种不同浓度的BBSKE作用SACC-83、SACCLM细胞48 h，检测Caspase-3活性（405 nm处的吸光度值）。随着BBSKE浓度增大，Caspase-3活性升高，且SACC-LM比SACC-83细胞升高更为明显，见图3，SACC-83 细胞：5 μmol/L组与对照组Caspase-3活性相比无明显变化，其相对活性分别为（1.27±0.16）和 1.00，而 10 μmol/ L组和20 μmol/L组Caspase-3相对活性分别为（1.44±0.18）和（1.8±0.04），显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；SACC-LM细胞：5 μmol/L 组、10 μmol/L 组 和 20 μmol/L组Caspase-3相对活性分别为（2.89±0.07）、（2.75±0.49）和（3.14±0.09），显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 不同浓度BBSKE对SACC-83、SACC-LM细胞中Caspase-3活性的影响

2.4 BBSKE对SACC细胞TrxR活性的影响 3种不同浓度的BBSKE作用SACC-83、SACC-LM细胞48 h后检测TrxR活性。SACC-83细胞：BBSKE对其TrxR活性无明显的影响；SACC-LM细胞：随着BBSKE浓度增大，TrxR活性明显降低。BBSKE 5 μmol/L 组、10 μmol/L 组 和 20 μmol/L组的TrxR活性（λ=412 nm处的吸光度值）分别为（0.113±0.003）、（0.088±0.007）、（0.046±0.017），见图4。

图4 BBSKE对SACC细胞TrxR活性的影响

3 讨论

本研究证实，新型有机硒化合物BBSKE对腺样囊性癌有抑制作用。其作用靶点是TrxR，通过抑制TrxR活性抑制癌细胞的增殖[10，13]。硫氧还蛋白（Trx）系统(TrxR、Trx、NADPH)是普遍存在于细胞内的氧化还原系统，在体内发挥着重要的抗氧化和氧化还原调控等作用[11]。Trx系统在促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡中发挥着重要作用。近年来，研究发现多种肿瘤细胞中的TrxR在转录和蛋白的表达水平都有所增加[12]。因此，控制癌细胞中的TrxR活性至关重要。含硒化合物可调节TrxR的活性。本实验发现，BBSKE对腺样囊性癌细胞的增殖也有抑制作用，且在其他细胞系中也有类似的结果[10-14]。

BBSKE可以调控细胞周期相关蛋白，如细胞周期蛋白A（cyclinA），细胞周期蛋白E（cyclinE），细胞周期抑制蛋白P21，细胞周期蛋白B1（cyclinB1），细胞周期蛋白D1（cyclinD1），细胞周期蛋-依赖性蛋白激酶4（Cdk4）等，使肿瘤细胞阻滞在细胞周期S期而抑制肿瘤细胞增殖；也可调控增殖、凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、核转录因子κB（NF-κB）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）促进肿瘤细胞凋亡[13]。Caspase-3是细胞凋亡的末端信号分子，其在决定细胞是否凋亡中起着重要作用。

同时，由于许多肿瘤细胞中TrxR表达水平高于正常细胞，所以BBSKE能特异性选择杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞的损伤很小。在不同的研究中发现，相同作用条件下，BBSKE 对正常肝细胞系HC7701(IC50-24 h∶53.83 μmol/L)的生长抑制作用比肿瘤肝细胞系Bel-7402 (IC50-24 h∶32.41 μmol/L)小；BBSKE对人胚胎肺二倍体细胞系CCC-HPF-1（IC50-24 h＞40 μmol/L）生长抑制作用明显低于肺癌细胞系 A459(IC50-24 h ∶ 7 μmol/L)[6，13]。BBSKE比亚硒酸钠具有更好的组织耐受性及低毒性，BBSKE还可通过增加正常及肿瘤鼠的相对脾重、脾淋巴细胞转化活性、自然杀伤细胞(NK)活性等，显著提高机体免疫力[14]。而染色体畸变试验证实BBSKE无致突变作用[15]。

本研究发现，BBSKE可以抑制腺样囊性癌细胞的增殖，且对腺样囊性癌高转移细胞系SACC-LM更为敏感。其作用机制可能是通过抑制细胞中TrxR的活性，升高Caspase-3活性实现的。但是BBSKE是否可以在体内抑制腺样囊性癌的生长或转移则需要人体内试验进一步验证。