基于全基因组SNP高效鉴定燕麦种质资源

徐金青，边海燕，王寒冬，王 蕾，张 波，尤 恩，李晓兰，陈文杰，沈裕虎

(1.中国科学院高原适应与进化重点实验室/青海省作物分子育种重点实验室/青藏高原作物种质资源研究与利用实验室,中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001;2.中国科学院种子创新研究院,青海西宁 810001;3.中国科学院大学生命科学学院,北京 100049)

燕麦是一年生禾本科作物，其栽培种多以六倍体(2n=6x=42)普通燕麦(AvenasativaL.)为主。据美国农业部统计，近年来燕麦产量保持在 2 000万t以上，在世界禾谷类作物中的种植面积和总产量次于小麦、玉米、水稻、大麦和高粱，居第六位[1]。燕麦富含β-葡聚糖，具有降血脂、维持血糖平衡和抑制胆固醇吸收的功效[2]，是美国FDA和英国JHCI认定的功能性谷物[3-4]。普通栽培燕麦分为皮燕麦和裸燕麦两种，中国栽培的燕麦主要为裸燕麦，主要分布在华北、西北、西南等地区，是重要的营养保健作物和搭配作物，也是优质的饲草作物。

随着燕麦产业的发展，优质燕麦品种数目不断增加，加上种质交流的日趋频繁，导致目前种业市场上种质混淆现象和套牌侵权现象时有发生。同时，在育种过程中，一批综合性状优良、配合力好的亲本被广泛应用，造成品种的遗传基础变窄以及近似品种数量增加，难以用形态学、生理生化等方法准确鉴定品种的真实性和纯度[5]。解决这些问题的根本在于对种质资源、育种材料和作物品种进行有效保护，从DNA水平上对农作物品种和材料进行鉴定是实施品种保护的基础。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记因其检测结果不受环境影响，操作简单，检测快速，且成本较低，被国际种子检验协会(ISTA)、国际植物新品种保护联盟(UPOV)、国际种子联盟(ISF)等国际组织推荐为品种身份鉴定的辅助方法[5-6]。研究者已在大麦[5]、水稻[7]、棉花[8-9]、油菜[10]等多个物种中开展了DNA指纹图谱的构建工作。刘伟[11]利用3对SSR引物构建了可区分3种不同倍性燕麦材料的指纹图谱。郭红媛等[12]利用公共数据库中的25 376条EST(Expressed sequence tags)序列，筛选得到40对有效的EST-SSR标记，可用于燕麦种质资源的基因组倍性鉴定。高 秋等[13]筛选出6对多态性好且扩增稳定清晰的SSR引物，并使用其中2对引物构建了10个国审燕麦品种的DNA指纹图谱，为燕麦品种的真伪鉴定提供了可用标记。

与SSR标记相比，SNP标记在基因组中分布密度更高、更均匀，且分型简单，更适合数据整合和共享，此外，其与功能基因尤其是植物表型基因关联度较高，因此，SNP标记被公认为是极具应用前景的分子标记技术[7]。但是，目前尚未见SNP标记用于燕麦指纹图谱构建的研究报道。本研究运用燕麦iSelect 6K微珠芯片[14]对25个生产上大面积推广的栽培燕麦品种进行基因分型，从中筛选出能够区分燕麦品种的核心SNP标记，并构建参试燕麦品种的DNA指纹图谱，以期为燕麦种质资源的科研、生产和推广工作提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取25个生产上大面积推广的普通燕麦栽培品种(表1)，在三叶期取新鲜叶片，用CTAB方法[15]提取基因组DNA，并采用紫外分光光度法检测基因组DNA浓度，稀释至100 ng·μL-1，于-20 ℃保存备用。

表1 25个普通燕麦栽培品种种质资源Table 1 Germplasm resources of 25 common oat cultivars

1.2 芯片基因分型及数据处理

用燕麦iSelect 6K微珠芯片对参试燕麦品种进行基因分型。该芯片含有4 975个多态性SNP标记。利用北京佳安卫康科技有限公司的Illumina SNP Genotyping技术测试平台完成iSelect 6K微珠芯片检测。获得的杂交信号输入Genomestudio V1.0软件进行标准化处理。根据SNP标记特性保留符合以下条件的SNP标记：(1)具有多态性；(2)缺失率小于0.50；(3)最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)大于0.05。采用PowerMarker V3.25[16]软件计算筛选获得的SNP标记的杂合率和遗传多态性信息指数(PIC)。

1.3 群体结构分析

用PowerMarker V3.25计算Nei氏遗传距离矩阵，用MEGA 6.0[17]的邻接法(neighbor joining，NJ)构建聚类树。用Admixture软件[18]分析群体结构，群体数K值设定为1～10。用GCTA软件[19]进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并利用前两个主成分进行作图。

1.4 核心SNP标记的选择及引物设计

根据基因分型的结果，筛选无基因型数据缺失的SNP用于构建燕麦DNA指纹图谱。用GenStat的去冗余(IRREDUNDANT)指令通过顺序算法(Sequential algorithm)[6,20]筛选出能将25份燕麦栽培品种完全区分开的核心SNP标记，标记序列详见参考文献14，用Primer 6中设计相应的PCR引物，由上海生工生物有限公司 合成。

1.5 核心SNP标记的准确性验证

PCR扩增引物稀释至10 μmol·L-1，DNA浓度稀释至100 ng·μL-1。PCR反应体系为 25 μL，包含2 μL样品DNA，2 μL 10×PCR反应缓冲液，1.6 μL 2.5 mmol ·L-1dNTP溶液，0.5 μL 10 μmol·L-1正向引物，0.5 μL 10 μmol ·μL-1反向引物，0.2 μL Taq DNA聚合酶，18.2 μL超纯水。反应程序：94 ℃预变性 4 min；95 ℃变性30 s，退火温度(具体见表2) 45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物送上海生工生物有限公司进行测序。将测序结果与芯片分型结果进行比较，保留芯片分型结果与测序结果一致的核心SNP标记。若测序结果与芯片分型结果不一致，则重新选择SNP标记进行扩增和测序验证，直到获得能够完全区分25份燕麦种质资源的核心SNP。

2 结果与分析

2.1 基因分型结果

利用燕麦iSelect 6K微珠芯片对本研究选取的25个燕麦栽培品种进行基因分型，结果表明，2 852(57.33%)个SNP标记具有多态性。删除缺失率大于50%和MAF小于0.05的标记，最终筛选到 2 214个SNP标记，其基因型检出率为97.96%。利用Powermarker V3.25软件计算SNP标记的杂合率，发现392个标记的杂合率小于0.05，占17.71%；757个标记的杂合率大于 0.50，占 34.19%。2 214个SNP标记的MAF均值为 0.75，PIC均值为0.28，变化范围为0.11～ 0.58，PIC值大于0.25的占63.23%。因此，通过燕麦iSelect 6K微珠芯片获得的SNP标记具有较高的多态性和可信度，可用于燕麦品种的指纹图谱构建与品种鉴定分析。

2.2 群体结构分析

基于Nei氏遗传矩阵绘制NJ聚类树，结果(图1)显示，25个普通栽培燕麦品种可以划分为5个类群。类群Ⅰ含有4个皮燕麦和2个裸燕麦品种；类群Ⅱ含有5个皮燕麦品种；类群Ⅲ含有4个裸燕麦和1个皮燕麦品种；类群Ⅳ含有3个皮燕麦品种；类群Ⅴ中含有3个皮燕麦和3个裸燕麦品种。群体结构分析结果(图2)显示，当K=2时，交叉检验误差(CV-error)最小，结合聚类分析结果，类群Ⅰ和类群Ⅴ聚为一个群体，剩余的组成另外一个群体。当K=3时，类群Ⅰ组成群体1，类群Ⅱ和类群Ⅲ组成群体2，类群Ⅳ和类群Ⅴ组成群体3。当K=4时，类群Ⅱ、类群Ⅲ分开。当K=5时，类群Ⅳ、类群Ⅴ分开。PCA结果(图3)显示，第一主成分(PCA1)可解释11.10%的遗传变异，可将类群Ⅱ和类群Ⅲ与其他三个类群分开。第二主成分(PCA2)可解释9.24%的遗传变异，可将类群Ⅰ与类群Ⅳ和类群Ⅴ区分开来。

图1 25个燕麦品种的聚类分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the 25 oat cultivars

图下方的品种编号对应表1的品种。

图3 25个燕麦品种的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the 25 oat cultivars

2.3 核心SNP标记的筛选及扩增验证结果

综合考虑基因分型的结果，筛选无基因型缺失的标记用于构建DNA指纹图谱，结果共获得 1 828个SNP标记。利用GenStat发现，区分25个燕麦品种至少需要8个SNP标记(表2)。根据SNP标记的侧翼序列，设计相应的引物进行PCR扩增和测序验证，发现8个SNP标记 (GM1～GM8)的测序结果与芯片分型结果一致(表2)，进一步证实这些核心SNP标记的可用性和准确性。8个SNP标记的MAF均值为0.62，PIC均值为0.35，其中GM2的PIC值最高，为 0.37，GM7的PIC值最低，为0.23，表明这8个SNP标记具有较高的遗传多样性。

表2 筛选出的8个SNP标记及其引物信息Table 2 Eight SNP markers screened out and their primer information

2.4 燕麦品种指纹图谱的构建

利用筛选出的8个SNP标记构建25个参试燕麦品种的DNA指纹图谱(表3)，发现这些标记具有较好的稳定性和重复性，可实现对燕麦品种真实性和特异性的有效鉴定。

表3 25个普通燕麦品种的指纹图谱Table 3 Fingerprint of the 25 common oat cultivars

3 讨 论

品种审定、登记及品种权保护，都必须通过DUS(Distinctness,uniformity and stability)测试，即对植物品种进行特异性、一致性和稳定性的种植鉴定试验。目前DUS测试主要依据外部形态来确定，分子标记只作为辅助手段。随着燕麦二倍体和六倍体基因组的相继发布[21]，与油含量、蛋白质含量、β-葡聚糖含量、抗病性、粒重、分蘖数、抽穗期、株高等诸多性状相关的QTL被发现和定位[22]，与这些QTL紧密连锁的功能标记既可用于目标性状检测，也可用于指纹图谱的构建[6-7]。因此，与表型性状QTL紧密连锁的分子标记，可以运用到DUS测试中，有利于减少田间种植成本以及提高检测的可靠性和效率。

将DNA指纹图谱应用于品种鉴定时，其结果的可靠程度主要依赖于分子标记的稳定性和多态性[9]。随着高通量测序和芯片技术的发展，发掘高质量SNP标记组合为燕麦品种的遗传多样性及身份鉴定提供了有效途径。本研究选取了25个燕麦育成品种，既考虑到参试品种的来源地，又考虑到品种的育成年代和推广应用情况，具有较好的代表性。在群体遗传结构分析中，NJ聚类树、群体结构分析及主成分分析的结果基本一致，可以将25个燕麦育成品种划分为5个类群。但是从类群的划分结果看，聚类分析的结果与育种单位、育种方式没有明显的关系。类群II和类群III的划分同燕麦的皮裸性密切相关。同时，本研究获得的8个SNP标记组合可将25个参试燕麦品种完全区分开，其PIC均值为0.35，说明这8个SNP位点多态性较高。另外，经过多次测序验证，均和基因分型结果一致且具有良好的重现性，说明这8个SNP标记适于构建燕麦品种指纹图谱，可以运用到燕麦品种的真实性鉴定和种子纯度鉴定中。

从本课题组前期对288个燕麦品种(大部分为国外地方品种和育成品种)进行iSelect 6K微珠芯片基因分型的结果(未发表)来看，青海444、巴燕4号和青燕1号以及科燕1号和白燕7号这两组材料均未能完全区分开来，只能用缺失标记进行区分。但是根据缺失标记设计引物，后续未能得到成功验证。说明燕麦iSelect 6K微珠芯片近 5 000个SNP标记对大群体材料的分辨力还不足，后续还需增加标记密度开发新的芯片才可满足燕麦种质资源鉴定的需求。经过测序验证，本研究挑选的8个SNP标记能够完全区分生产上曾大面积推广应用的25个燕麦栽培品种。从理论上讲，SNP标记为二态时，8个标记可以将256(28=256)个品种完全区分开来，因此本研究筛选得到的SNP标记集在区分燕麦品种上仍然较大的扩容空间，可继续对该SNP集区分品种的能力进行评估。在今后的工作中，随着品种数量的增多、品种指纹图谱数据库的进一步丰富，高通量SNP检测技术在育成品种的真实性、特异性鉴定方面将具有非常广阔的应用前景。