韩东,杜霞,李林林,刘金华,彭修娟,张鑫,龚伟玲,李波,刘峰,,6*(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 7106;.陕西国际商贸学院,陕西 咸阳 7106;.陕西省中医药研究院,西安 71000;.保定天浩制药有限公司,河北 保定 0760;.陕西步长制药有限公司,西安 71007;6.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心,西安 71007)
肝爽颗粒是由党参、柴胡(醋制)、白芍、当归、茯苓、白术(炒)、枳壳(炒)、蒲公英、虎杖、夏枯草、丹参、桃仁、鳖甲(烫)组成的中药复方制剂,具有疏肝健脾、清热散淤、保肝护肝、软坚散结的作用,临床上已经被用于治疗各种慢性肝脏疾病[1-4]。
近些年来,中草药受到世界各国的广泛关注,中国有出口的中药材近500 种,中成药2000多种,全球药用植物的消费额约140 亿美元,预计到2050年将增至5 万亿美元[5]。随着中药材的蓬勃发展,人们越来越重视其质量和安全。重金属等有害元素在药材体内富集蓄积情况普遍,影响人体健康,也引起大量关注[6]。与此同时,随着现代药物分析对中药制剂研究的不断深入,人们不仅对中药制剂有机成分进行了详细研究,无机元素所发挥的作用也越来越受到关注[7]。
目前测定重金属元素的方法有很多,如原子荧光分光光谱法[8]、原子吸收分光光谱法[9]、电感耦合等离子体发射光谱法[10]等,其中,电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)具有极低的检测限、线性动态范围宽、灵敏度高、准确、分析速度快等特点,已经用于多种中成药的无机元素分析[11-15]。因此本试验采用微波消解ICP-MS 法对肝爽颗粒中无机元素进行测定,并且采用聚类分析法和主成分分析法(PCA)对无机元素进行分析,明确肝爽颗粒的特征无机元素,以期从无机元素层面评估肝爽颗粒的质量均一性和安全性。
Muiti Wav PRO 41HVT56 微波消解仪[安东帕(美国)有限公司];TE124S 电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];Milli-Q Reference 超纯水仪[默克化工技术(上海)有限公司];ICAP RQ ICP-MS 电感耦合等离子体质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)。
铟(In)单元素标准溶液(批号:203044-2)、汞(Hg)单元素标准溶液(批号:207031-1)[1000 μg·mL-1,国标(北京)检验认证有限公司];锗(Ge)单元素标准溶液(1000 μg·mL-1,批号:207002)、混合标准溶液[含铝(Al)、砷(As)、硼(B)、钡(Ba)、钙(Ca)、镉(Cd)、钴(Co)、铬(Cr)、铜(Cu)、铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(Mo)、钠(Na)、镍(Ni)、铅(Pb)、锑(Sb)、硒(Se)、锡(Sn)、锶(Sr)、钛(Ti)、铊(Tl)、钒(V)、锌(Zn),均为100 μg·mL-1,批号:20DB390](国家有色金属及电子材料分析测试中心);硝酸(HNO3,质量分数为65%),水为超纯水(Milli-Q 制水系统制得)。肝爽颗粒(保定天浩制药有限公司,批号:200814、200815、200816、201215、201216、201217、201218、201219、201220、201221, 编号:S1 ~S10,规格:每袋3 g)。
精密移取适量的混合标准品溶液,用10% HNO3溶液稀释,制成质量浓度为1 μg·mL-1的标准品储备液,再用2%HNO3溶液依次稀释,配制成含Na、B、Mg、Al、Ti、K、Cr、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Sr、Sn、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 分别为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0、175.0、200.0、250.0、500.0、750.0、1000、2000、5000 μg·L-1的标准品溶液。精密移取适量的Hg 单元素标准溶液,用10% HNO3溶液稀释成0.5 μg·mL-1的溶液,作为Hg 的标准储备液,精密移取Hg 的标准储备液,用2% HNO3溶液稀释,制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5 ng·mL-1的标准品溶液(临用时现配)。
分别精密移取适量的Ge 和In 单元素标准溶液,用10% HNO3稀释成1 μg·mL-1的混合内标储备液。精密移取混合内标储备液,用2%HNO3溶液稀释成20 ng·mL-1的溶液,作为内标溶液。
取肝爽颗粒样品粉末约0.5 g,精密称定,量于聚四氟乙烯消解罐中,加入浓HNO3溶液8 mL,混匀,于100℃下预消解30 min,待温度降至60℃以下,轻轻振荡后混匀置微波消解仪中,按照表1 设定的消解程序消解,消解完成后,待消解液冷却至55℃取出,于通风橱中80℃将硝酸挥发至约1 mL,转入50 mL 量瓶中,用少量的水洗涤消解罐,洗涤3 次,洗液同时合并于量瓶中,加水定容至50 mL,摇匀,即得。同法制得空白样品溶液。
表1 微波消解程序Tab 1 Program of microwave digestion
采用氦气碰撞-动能歧视模式进行样品分析,RF 功率1550 W;雾化室温度2.7 ℃;辅助气体积流量0.8 L·min-1;冷却气体积流量14 L·min-1;雾化气体积流量1.031 L·min-1;蠕动泵泵速40.0 r·min-1;驻留时间0.05 ms;扫描次数25 次;反应池气(He)体积流量5.4 mL·min-1;取样锥为Ni 锥;采样深度为10 mm。
测定Na、B、Mg、Al、Ti、K、Cr、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Sr、Sn、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 共26 种元素,其中相对分子质量小于100 的元素采用Ge 作为内标、相对分子质量大于100 的元素采用In 作为内标。样品按质量浓度由低到高依次进行测定。
2.6.1 线性关系考察 取“2.1”项下配制的各混合标准品溶液及Hg 单元素标准品溶液,进行测定,以标准品的质量浓度为横坐标(X),强度结果为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得到各元素的线性方程及相关系数,结果见表2。
2.6.2 检测限和定量限 连续测定空白样品溶液11 次,测定元素信号响应值,以其信号响应值的标准偏差的3 倍所对应的质量浓度为检测限(LOD),10 倍所对应的质量浓度为定量限(LOQ),结果见表2,各元素的检测限和定量限均能满足分析要求。
表2 26 种元素的线性关系、检测限及定量限考察结果Tab 2 Linearity,LOD,and LOQ of 26 elements
2.6.3 精密度试验 取“2.1”项下混合标准品溶液及Hg 单元素标准品溶液,连续进样6 次,结果各元素精密度RSD在0.19%~4.2%,表明仪器精密度良好。
2.6.4 重复性试验 取肝爽颗粒(批号:200815)约0.5 g,精密称定,按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液,测定,计算各元素含量,结果Se、Mo、Sb、Tl、Hg 未检出,其余各元素重复性RSD在0.82%~3.5%。
2.6.5 稳定性试验 取肝爽颗粒(批号:200815)约0.5 g,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h 测定,计算各元素RSD值,结果Se、Mo、Sb、Tl、Hg 未检出,其余各元素的含量RSD在0.65%~4.7%。
2.6.6 加样回收试验 取肝爽颗粒(批号:200815)约0.25 g,精密称定,加入浓HNO3溶液8 mL,加入与样品中各元素质量相当的混合标准品溶液及0.5 μg·mL-1的Hg 标准品储备液200 μL,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,平行制备3 份,同法制备空白样品溶液。测定各元素的含量,计算回收率。结果各元素的平均回收率在88.07%~106.82%,RSD在1.1%~4.9%。
取10 批肝爽颗粒,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.4”及“2.5”项下方法测定样品中26 种无机元素的含量,结果见表3。
将ICP-MS 采集的数据导入Excel 表格中保存为CSV 格式,通过Metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)网站生成Heatmaps 图,使用软件SPSS 25.0 对10 批肝爽颗粒的无机元素质量分数进行Pearson 相关性分析;将各元素的质量分数扩大或缩小到同一数量级,之后使用GraphPad Prism 6 软件绘制肝爽颗粒的无机元素指纹图谱及对照图谱;采用软件SPSS 25.0 对10 批肝爽颗粒的无机元素质量分数进行聚类分析,并使用软件Simca 14.1 绘制PCA 散点图,对肝爽颗粒进行均一性分析。采用软件SPSS 25.0 对数据标准化后进行PCA,据初始特征值和累计贡献率提取主成分因子,对提取的主成分因子进行载荷矩阵,由负荷量的大小来寻找肝爽颗粒的特征元素。
10 批肝爽颗粒中26 种无机元素的测定结果见表3。可以看出,肝爽颗粒中26 种无机元素的含量差异很大,K 元素的含量最高,其平均质量分数为24 439.205 μg·g-1,其次含量较高的元素为Mg(2367.733 μg·g-1)、Na(956.278 μg·g-1)、Ca(532.418 μg·g-1)、Al(51.712 μg·g-1)、Fe(47.354 μg·g-1)、Mn(21.296 μg·g-1)。这些元素含量占26 种元素含量的99.38%,如图1 所示,K、Mg、Na、Ca 大 于100 mg·kg-1,Al、Fe、Mn、Sr、B、Zn 在10 ~100 mg·kg-1内,Ba、Ti、Cu、Ni 在1 ~10 mg·kg-1内,As、Co、Cr、V、Pb、Sn、Cd 小于1 mg·kg-1。此外,Se、Mo、Sb、Tl、Hg 元素在部分肝爽颗粒批次中的含量低于检测限。《中国药典》2020年版中对中药材的重金属及有害元素的限度规定,Cu 不得过20 mg·kg-1、As 不得过2 mg·kg-1、Cd 不得过1 mg·kg-1、Hg 不得过0.2 mg·kg-1、Pb 不得过5 mg·kg-1。本试验测定的10 批肝爽颗粒样品中5 种重金属元素Cu、As、Cd、Hg、Pb 均未超标,说明肝爽颗粒的重金属含量在安全限度范围之内。
图1 肝爽颗粒各元素含量分析Fig 1 Content of each element in GSG
为了更直观地表示不同批次肝爽颗粒中各无机元素的含量的高低,绘制Heatmaps 图时,由于元素Se、Mo、Sb、Tl、Hg 在多批肝爽颗粒中含量低于检测限,将这些数据剔除,结果见图2。批号201217 样品中Zn、Cr、Cu、Al 含量高外,其余各元素整体含量均较低。批号200814 和批号201216 样品中V、Fe、Sn、As、B、Sr 含量均较高,其余各元素含量较低。由表3 和图2 可见,同一元素在不同批次之间的含量存在一定差异,如Na 元素含量最低值为914.831 μg·g-1,最高可达1008.559 μg·g-1。由表3 可见,Cr 元素及Pb 元素的变异系数较大,其次是Zn 元素,说明在不同批次的样品之间,Cr、Pb 和Zn 元素含量波动较大。而Ni 元素的变异系数较小,说明其含量在不同批间样品之间较稳定。
图2 肝爽颗粒中无机元素含量的热图分析Fig 2 Heatmaps of inorganic elemental contents in GSG
表3 肝爽颗粒中无机元素的质量分数(n =3)Tab 3 Inorganic elemental content of GSG (n =3)
进一步分析各元素的Pearson 相关性,同样剔除Se、Mo、Sb、Tl、Hg 元素数据。在图3 中各元素的相关矩阵分列显示,有11 对元素极显著相关(P<0.01),其中K 与Mg、Ca 与Mg、Ca 与K、Mn 与K、Cd 与Co 为正相关;Cu 与B、V 与Mg、Ca 与V、Fe 与V、Sr 与Cu、Pb 与Sn为负相关;有21 对元素显著相关(P<0.05),其中Mg 与Na,K 与Na、Ca 与Na、As 与B、Sr与B、Mn 与Mg、Ca 与Ti、Mn 与Ca、As 与V、Zn 与Cu、Cd 与Cu、Sr 与As、Sn 与As 为正相关。Zn 与B、Pb 与Al、V 与K、Sn 与K、As 与Ca、Pb 与Mn、As 与Cu、Cd 与Sr 为负相关。成正相关的18 对元素在被吸收积累过程中具有很好的协调作用,而成负相关的14 对元素在被吸收积累过程中具有拮抗作用。
图3 肝爽颗粒中无机元素之间的Pearson 相关性分析Fig 3 Pearson correlation between inorganic elemental in GSG
由于肝爽颗粒中26 种无机元素含量数量集差别较大,为了更直观准确地绘制质量分数分布曲线,将不同元素的含量扩大或缩小至同一数量级(K 缩小1000 倍,Mg 缩小100 倍,Na、Ca 缩小10 倍,Ti、Ni、Cu、Ba 扩 大10 倍,Cr、V、Co、As、Pb 扩大100 倍,Sn、Cd 扩大1000 倍),以元素种类为横坐标(相对含量为纵坐标),得到26 种元素质量分数分布曲线图见图4,10 批肝爽颗粒峰形相似,因批次不同,相对含量略有差异,但其谱线的形状及走势基本一致,故质量分数分布图可作为肝爽颗粒的无机元素特征指纹图谱,从整体上直观显示不同批次肝爽颗粒的差异,反映原料药材来源、等级、制备工艺的稳定性,有利于肝爽颗粒质量标准的完善。将10 批样品以平均数和中位数分别生成肝爽颗粒的无机元素对照指纹图谱,通过夹角余弦法计算10 批样品与生成的对照图谱的相似度,夹角余弦值接近1,说明相似程度高(见表4)。由表4 可见,10 批肝爽颗粒的指纹图谱与平均数、中位数对照图谱的夹角余弦值均大于0.976,说明各批次间无机元素指纹图谱的相似度高,即不同批次的肝爽颗粒无机元素的质量均一性较好。
图4 肝爽颗粒中无机元素质量分数Fig 4 Content distribution of inorganic elements in GSG
表4 肝爽颗粒无机元素指纹图谱相似度分析Tab 4 Similarity evaluation on inorganic elemental fingerprint of GSG
进一步采用多元统计分析对10 批肝爽颗粒的质量均一性进行分析。从聚类分析可以看出,10批样本可分为3 组,201217 单独为一组、200814和201216 为一组,其他样本为一组(见图5)。从PCA 散点图可以看出200814 和201216 聚集在一起,201217 单独为一组,其他样本为一组(见图6)。即PCA 和聚类分析结果基本一致。说明肝爽颗粒质量均一性较好。这3 批样品与其他样品存在差异的原因在于201217 样品中Zn、Cr、Cu、Al 含量高外,其余各元素整体含量均较低。批号200814 和批号201216 中V、Fe、Sn、As、B、Sr含量均较高,其余各元素含量较低。
图5 10 批肝爽颗粒无机元素的聚类分析Fig 5 Cluster analysis of inorganic elemental in 10 batches of GSG
图6 10 批肝爽颗粒无机元素的PCA 散点图Fig 6 PCA scatter plot of inorganic elemental in 10 batches of GSG
采用SPSS 25.0 软件对上述10 批肝爽颗粒样品的25 种无机元素(Hg 除外)数据进行PCA。PCA 可将原来的变量重新组合成一组新的综合变量,并从中取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来的变量信息。根据Kaiser 准则(特征值大于1)及累计贡献率准则(累计贡献率达80%或85%以上),前5 个成分的特征值均大于1,累计贡献率达92.369%,说明这5 个成分可以解释92.369%的原始数据变量信息(见表5)。因此提取这5 个主成分的因子进行分析。由因子载荷矩阵(见表6,按负荷量的大小进行排序)可知,第一个主成分因子中Mg、K、Ca、Mo、Tl 的负荷量较大,第二个主成分因子中Cd、Se 的负荷量较大,第三个主成分因子中Zn 的负荷量较大,均在0.85 以上。所以确定Mg、K、Ca、Mo、Tl、Cd、Se、Zn 是肝爽颗粒的特征无机元素。正或负相关性元素对表明这些无机元素在治疗过程(或吸收累积过程)中可能具有一定的协同或拮抗作用[16]。
表5 主成分的初始特征值和贡献率Tab 5 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components
表6 前5 个主成分的因子载荷矩阵Tab 6 Factor loadings matrix of first five principal components
本研究采用ICP-MS 对肝爽颗粒中26 种无机元素的含量进行了指纹图谱分析,初步明确了其无机元素的组成。结果显示肝爽颗粒中的无机元素以K、Mg、Na、Ca、Al、Fe、Mn 为主,含量最高的是K,其次是Mg、Na、Ca、Al、Fe、Mn,这7 种元素占测定元素总量的99.38%。通过计算不同元素的变异系数,发现Cr 及Pb 的波动较大,其次是Zn 元素。分析可能是同一产地不同批次或不同生长年份导致的差异。Pearson 分析显示,这些不同元素含量之间存在一定相关性。此外,Cu、As、Cd、Hg、Pb 是对人体有害的微量元素,肝爽颗粒中Cu、As、Cd、Hg、Pb 的限量符合《中国药典》2020年版以及《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中对中药材重金属及有害元素的限度规定[17-18]。即从重金属的角度来看,肝爽颗粒是安全的。进一步采用平均数和中位数法分别建立无机元素对照指纹图谱,不同批次的样品均有相似的峰形,且不同无机元素的多寡顺序趋于一致。由于中药元素谱分析数据量大,运用可以将抽象数据基于一定算法分成相似组的简化数据方法,以及降维思想的PCA,在减少分析指标的同时,尽可能多地保留原指标包含的信息,也能较好地挖掘肝爽颗粒多批次间的共同特征[19]。从聚类分析、PCA 结果来看,肝爽颗粒无机元素的质量均一性较好。PCA 结果显示,Mg、K、Ca、Mo、Tl、Cd、Se、Zn 是肝爽颗粒的特征无机元素,其中,Mg 存在于线粒体中,是参与代谢功能的重要辅助因子,有研究表明Mg 的缺乏会导致肝硬化加重,而服用Mg 则可以缓解肝硬化[20];K元素可以改善细胞膜纤维化,增强细胞膜的通透性,有助于损伤组织细胞的再生修复[21]。Se 元素在人体的多种调节和代谢中起着重要的作用,对于肝硬化患者体内元素的平衡是有益的[22];Zn 元素在各种Zn 酶中起着至关重要的作用,而Zn 酶可维持肝功能,患有慢性肝病的患者通常Zn 含量较低,随着肝纤维化的进展,Zn 浓度会进一步降低,补充Zn 对于维持肝功能、抑制肝癌的发展有一定的作用[23]。本研究结果显示肝爽颗粒含有治疗肝脏类疾病的必需元素,这也为后续研究药效发挥及之间的协同作用提供了参考。