牛至油及其主要成分对脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用研究

许璐，曹宇，朱瀚朝，王四旺，汤海峰*（.空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室，西安 7003；.空军军医大学西京医院心血管外科，西安 7003）

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征，其本质是宿主对感染的反应。这种反应一旦失调，将引起宿主器官功能障碍，严重者危及生命，全球每年已有数百万人死于脓毒症[1-3]。心肌功能障碍是临床脓毒症的主要并发症之一，与病死率的增加密切相关，伴有心肌功能障碍的患者病死率达70%～90%，远高于没有心肌功能障碍的患者[4]。越来越多的证据表明，氧化应激、炎症损伤在脓毒症引起的心肌功能障碍的发病机制中起着关键作用[5-6]。

牛至油（origanum oil，ORG）是从植物牛至（Origanum vulgareL.）中提取的一种具有特殊芳香气味的挥发油，约占全株重量的0.5%～7%；香芹酚（carvacrol，CAR）和麝香草酚（thymol，THY）是牛至油中生物活性较强的两种成分[7-8]。牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚可作为食品添加剂和化学香料，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗真菌、抗癌、保肝、扩张血管等多种药理活性[9-11]。目前，对牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚的研究大多为体外研究，其潜在的临床应用价值鲜见报道。本实验采用腹腔注射脂多糖（LPS）诱导小鼠脓毒症致心肌损伤模型，通过观察小鼠心脏功能、心肌组织的病理变化以及炎症细胞因子、氧化应激等的变化，探讨牛至油及其所含香芹酚和麝香草酚对LPS 诱导小鼠心肌损伤的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物

8 ～10 周雄性C57BL/6 小鼠， 体质量20 ～25 g [空军军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK（军）字第2019-001 号]。动物实验方案由空军军医大学动物福利伦理委员会（中国西安）审查，批准文号：SYXK（陕）2019-001，严格按照实验室动物使用指南进行。

1.2 试药

牛至油（批号：20180404，江西省吉水县俊达天然香料油厂）；香芹酚（批号：20170603，吉水县益康天然香料油提炼厂）；麝香草酚（批号：20170415，上海迈坤化工有限公司）；亚胺培南（imipenem，IPM，Merck Sharp & Dohme Corp）；脂多糖（LPS，北京索莱宝科技有限公司）；异氟烷（山东科源制药股份有限公司）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；苏木素-伊红（HE）染液（武汉谷歌生物科技有限公司）。

1.3 仪器

小动物超声成像系统（加拿大Visual Sonics 公司）；荧光显微镜、FV 10i 激光共聚焦显微镜（日本Olympus 公司）；电子分析天平（德国Sartorius公司）；移液枪一套（德国Eppendorf 公司）；全自动研磨仪（赛维尔生物）；低速离心机（湖南赛特湘仪有限公司）；超纯水系统（青岛富勒姆科技）；－80℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher 公司）；酶标仪（美国Bio-TeK 公司）；电子恒温水浴锅（姜堰市天力医疗器械厂有限公司）。

2 方法

2.1 实验分组及给药

所有小鼠适应性饲养一周后，称质量，随机分为6 组，每组12 只，分组及给药情况如下：正常对照组（CON），正常饮食饮水；牛至油（LPS＋ORG，50 mg·kg－1）、香芹酚[9，12]（LPS ＋CAR，40 mg·kg－1，与50 mg·kg－1牛至油中所含香芹酚等量）及麝香草酚（LPS ＋THY，5 mg·kg－1，与50 mg·kg－1牛至油中所含麝香草酚等量）、亚胺培南（阳性药，LPS ＋IPM，120 mg·kg－1）组分别灌胃给药，模型组灌胃与给药组等量的生理盐水，每日一次，连续7 d。除正常对照组动物外，其余各组小鼠末次给予试药（第7日）后1 h 腹腔注射10 mg·kg－1LPS 诱导脓毒症心肌损伤模型。

2.2 小鼠一般情况观察

观察各组小鼠在给药及造模前后饮食饮水，反应及活动情况。

2.3 超声心动图测量

造模12 h 后，各组随机选取6 只小鼠放入麻醉箱中，异氟烷吸入麻醉，脱去胸腹部被毛，仰位固定于加热板上（37℃），维持2%异氟烷流速以稳定小鼠麻醉状态，胸部涂抹超声耦合剂，将超声探头紧贴小鼠心脏位置，调整探头记录M 型超声心动图，获得左室心脏活动图像（心动图）。使用Vevo LAB 3.1.0 软件连续测量3 个心动周期后取平均值，计算左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）。

2.4 心肌酶检测

各组动物检测心功能后，经颈动脉采集血液留存，4 ℃过夜，4000 r·min－1离心15 min，吸取上层血清保存在－80℃冰箱。各组随机选取8 只小鼠血清，按照说明书步骤检测血清中LDH和CK-MB 的水平。

2.5 心肌组织HE 染色

各组随机选取4 只小鼠，心脏行多聚甲醛（PFA）灌注后剖取，固定在4% PFA 溶液中，石蜡包埋，切片；再经苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。

2.6 小鼠血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量

各组随机选取8 只小鼠血清，按照说明书步骤采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量。

2.7 小鼠心肌组织中SOD、MDA 水平检测

心脏经主动脉灌注PBS 后，立即冻存于液氮中。选取8 只小鼠心脏组织，匀浆，离心后取上清液，按照说明书步骤检测组织中SOD 和MDA 的水平。

2.8 心脏组织活性氧（ROS）染色

选取8 只小鼠心脏组织，制作心肌冰冻切片，用DHE 染色检测细胞内ROS 水平。奥林巴斯FV1000 激光共聚焦显微镜对处理过的组织切片进行检测，平均荧光强度测定采用Image-Pro plus分析。

2.9 数据分析

所有数据使用GraphPad Prism 8.0 软件分析，数据以±s 表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般情况观察

造模前各组小鼠活动正常，饮食饮水正常。腹腔注射LPS 后，小鼠出现精神萎靡不振，毛发松乱，行动迟缓，对外界刺激反应迟钝，饮食饮水减少，出现寒颤状况，眼角周围有白色分泌物产生，粪便不成形，肛门处有粪便粘连。上述情况在亚胺培南、牛至油及香芹酚用药组中明显较轻；麝香草酚组改善不明显。

3.2 超声心动图评价心功能

LPS 注射12 h 后，采集M 型超声，结果如表1 和图1 所示。与正常对照组比较，模型组小鼠出现左心室功能障碍，LVEF 和LVFS 值明显下降（P＜0.01），提示注射LPS 导致小鼠心脏收缩功能下降，心功能降低。与模型组相比，牛至油及香芹酚干预组的LVEF 和LVFS 明显升高（P＜0.05，P＜0.001），麝香草酚组LVEF 和LVFS 值具有升高趋势，但差异无统计学意义。牛至油和香芹酚组间差异无统计学意义。

图1 超声心动图Fig 1 Cardiac function by echocardiography

表1 各组小鼠心功能相关指标比较 (x±s，n ＝6)Tab 1 Myocardial function indexes of mice in each group(x ±s，n ＝6)

3.3 各组小鼠血清中心肌酶及炎症因子的比较

结果见表2，与正常对照组相比，LPS 诱导的心肌损伤小鼠血清中CK-MB、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β水平明显升高（P＜0.01）， 提示LPS 促使大量炎性因子入血。亚胺培南、牛至油及香芹酚干预组血清中CK-MB、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β含量均明显下降（P＜0.05，P＜0.01），说明亚胺培南、牛至油及香芹酚可抵抗LPS 促炎性因子释放，从而改善心肌炎症损伤。香芹酚组与牛至油组相比各项指标无显著性差异。而麝香草酚组各项指标与模型组相比无明显差异。

表2 各组小鼠血清中心肌酶及炎症因子的比较 (x ±s，n ＝8)Tab 2 Myocardial enzymes and inflammatory factors in each group (x ±s，n ＝8)

3.4 心脏组织病理学的变化

HE 染色光镜下观察，心肌及心肌细胞组织形态学变化见图2。与正常对照组相比，LPS 诱导的小鼠脓毒症心肌损伤，其心肌纤维排列不规则，一部分横纹模糊甚至消失；可见血管出血，炎性细胞浸润，表明腹腔注射LPS 成功构建脓毒症心肌损伤模型。亚胺培南、牛至油和香芹酚干预小鼠的上述病变明显获得保护，可见心肌细胞排列整齐，结构及边界明显，炎症细胞浸润较少。

图2 小鼠心脏组织的病理学变化（×400，n ＝4）Fig 2 Histopathology of the heart tissues in each group（×400，n＝4）

3.5 各组小鼠心肌氧化应激水平的比较

如图3 和表3 所示，相比于正常对照组，注射LPS 后，小鼠心肌组织中SOD 活性显著降低，MDA 浓度显著升高，ROS 活性显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，亚胺培南、牛至油和香芹酚预给药组SOD 活性显著升高，ROS 及MDA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而麝香草酚组与模型组相比差异无统计学意义。

表3 各组小鼠心脏组织SOD 和MDA 的水平(x±s，n ＝8)Tab 3 SOD and MDA levels in heart tissues of mice in each group(x±s，n ＝8)

图3 各组小鼠心脏组织ROS 的表达（×400，n ＝4）Fig 3 Expression of ROS in heart tissues of mice in each group（×400，n ＝4）

4 讨论与结论

本研究从小鼠的一般状况、心功能、心肌损伤标志物以及组织病理学等多方面进行综合评价，表明牛至油及其所含等剂量的香芹酚能够减轻脓毒症心肌损伤模型小鼠心功能障碍，显著减缓 LPS 诱导小鼠的心肌损伤，而麝香草酚作用较为有限。脓毒症期间的氧化应激是导致心肌功能障碍的一个关键因素[15]。在脓毒症期间，过多的ROS 可激活脂质过氧化，导致细胞和线粒体膜损伤，从而引发细胞凋亡和坏死[16]，进一步引起大量内毒素的释放，触发一系列促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6 等）释放造成严重且持续的炎症反应[17-18]，诱导心肌损伤。在心肌组织中，SOD 对调控ROS 生成方面起主要作用，是体内重要的抗氧化酶[19]；MDA 是细胞膜磷脂在氧化应激损伤过程中形成的产物，可反映脂质过氧化的严重程度[20]。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠心肌组织MDA 含量增加，SOD 活性明显降低；而牛至油和香芹酚预处理组小鼠心肌组织MDA 含量降低，SOD 活性升高，表明牛至油和香芹酚可显著抵抗LPS 诱发心肌组织的氧化应激反应。此外，牛至油及香芹酚明显降低模型小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平，表明牛至油及香芹酚抑制了LPS 诱导的炎症因子产生与释放，提示其对心肌保护作用可能与抗炎作用有关。综上，香芹酚可能是牛至油中保护LPS 诱发的脓毒症心肌损伤的有效成分，但其发挥作用的剂量效应关系及确切分子机制尚待进一步研究。