载芍药苷的甘草次酸修饰脂质聚合物杂化纳米粒的理化性质表征及体外靶向性评价

刘琪琪，王春柳，周洁，宗时宇，刘洋，张红，李晔（.陕西省中医药研究院，西安 70003；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 72046）

肝脏疾病如病毒性肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、肝癌等在我国的发病率一直居高不下。据统计，在中国有超过20%的人群受到肝脏疾病的困扰，尤其是乙肝、丙肝、肝硬化、肝癌、酒精性肝病和药物性肝损伤等。开展肝靶向给药系统研究，将药物定位、聚集于肝脏病变部位一直是临床和基础研究的关注点。甘草次酸（GA）为甘草的主要有效成分，大量研究表明，肝细胞膜上有大量与GA 相结合的位点，是天然的肝靶向递药系统的修饰分子[1-2]。

脂质-聚合物杂化纳米粒（LPHNPs）是一类基于脂质体和聚合物纳米粒发展的新型载药系统，在靶向给药方面优势独特[3-6]，其核壳结构兼具聚合物纳米粒的刚性与磷脂结构的柔性，且易于修饰，具有广泛的应用前景。芍药苷（Pae）是中药芍药的主要有效成分，已有研究表明，芍药苷在脂肪肝、肝纤维化、肝肿瘤中均有显著疗效[7-9]。

本文制备了一种载芍药苷的甘草次酸介导的脂质-聚合物杂化肝靶向给药系统（GA-LPHNPs-Pae），并对其进行体外理化性质表征和基于体外细胞模型的初步靶向性验证，可为新型中药肝靶向药物开发奠定基础。

1 仪器与试药

超声波细胞粉碎机（MD-1000D，南京舜玛仪器设备有限公司）；激光粒度分析仪（ZEN3600，马尔文仪器）；数显多头磁力恒温搅拌器（HJ-6B，金坛市城东盛联实验仪器厂）；精密电子天平（BT125D）、旋转蒸发器（RE-52AA）（上海亚荣生化仪器厂）；光学显微镜（CKX31，日本奥林巴斯）；二氧化碳培养箱（3111，Thermo 公司）；激光共聚焦扫描显微镜（TCS MP5，LEICA）；傅里叶变换红外光谱仪（Tensor27，Bruker 公司）。

芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度：95.7%，成都克洛玛生物科技有限公司），PEG-PLGA、GA-DSPE-PEG、大豆卵磷脂（西安瑞希生物科技有限公司），聚乙烯醇（PVA，Mn ＝13 000 ～23 000， 美国Sigma Aldrich 公司），葡聚糖凝胶G-50（长征制药厂），HepG2细胞（中国科学院细胞库），DMEM 培养基（批号：ME100202P1）、 胎牛血清（批号：10099-141）、胰酶消化液（批号：25200-056）、青链霉素双抗混合液（批号：15140）（GIBCO），DAPI（1∶2000，上海碧云天生物技术研究所），FITC（95%，美伦生物），甲醇（赛默飞世尔科技中国有限公司），无水乙醇、乙酸乙酯及其他试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 GA-LPHNPs-Pae 制备

以大豆卵磷脂、GA-DSPE-PEG、胆固醇作为壳层材料，以PEG-PLGA 为核层材料，采用两步法制备GA-LPHNPs-Pae，其中内核层采用复乳法制备。

精密称取PEG-PLGA 聚合物适量置于西林瓶中，加入乙酸乙酯5 mL 溶解。称取适量芍药苷，加水配至质量浓度为500 mg·mL－1，移液器移取0.5 mL 超声分散于有机相中，采用细胞破碎仪300 W 功率超声乳化3 min，形成油包水（W/O）型初乳，在1500 r·min－1磁力搅拌下将初乳缓慢滴加到1% PVA 分散液中，冰浴下继续采用细胞破碎仪乳化2 min，在1000 r·min－1磁力搅拌6 h 以除去有机溶剂，即得NPs-Pae 分散液。

取一定量蛋黄卵磷脂、GA-DSPE-PEG、胆固醇以适量乙醇溶解，转移至圆底烧瓶中，40℃减压去除溶剂至内壁形成均匀脂质膜，采用10 mL NPs-Pae 分散液在60℃水化30 min，取出采用细胞破碎仪100 W 功率超声3 min，即得GALPHNPs-Pae 粗分散液。

2.2 GA-LPHNPs-Pae 粒径分布与电位分析

分别取NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 溶液适量，经蒸馏水稀释10 倍后进行Zeta 电位测定，稀释100 倍后测定粒径分布，结果见图1。

图1 粒径与分布Fig 1 Particle size and distribution

NPs-Pae 的粒径、分散指数和Zeta 电位分别为（90.27±1.99）nm、（0.115±0.001）、（－6.78±1.70）mV，表明纳米粒的粒径大小均一、整个体系比较稳定。

GA-LPHNPs-Pae 的粒径、分散指数和Zeta电位分别为（96.98±0.39）nm、（0.104±0.005）、（－13.10±0.26）mV，表明经过修饰后的纳米粒粒径稍有增大，分布较窄，电位绝对值有增加，整个体系更加稳定。

2.3 GA-LPHNPs-Pae 红外分析[4，10]

采用KBr 压片法，将 NPs-Pae、GA-LPHNPs-Pae 和GA-DSPE-PEG 粉末样品分别与溴化钾1∶100 混合研磨至均匀，压成透明的薄片，在400 ～4000 cm－1内记录样品骨架红外振动吸收峰，测试分辨率为 4 cm－1，结果见图2。

由图2 可知，与NPs-Pae 相比，GA-DSPE-PEG和GA-LPHNPs-Pae 在1250 cm－1处有一锐利小峰，为羧基中的羟基峰峰位，虽然3 个样本中均有羟基存在，但PEG 中的羟基为聚合状态，而GA 中羟基属为游离态；另外，在指纹区690 cm－1峰位处，GADSPE-PEG 和GA-LPHNPs-Pae 较NPs-Pae 多出一个锐利小峰，可能为GA 结构中C 环和D 环共有13号碳的三取代的特征峰位，上述两处峰位对比说明GA-LPHNPS-Pae 表面修饰了具有游离羟基的GA。

图2 红外分析图Fig 2 IR analysis diagram

2.4 GA-LPHNPs-Pae 包封率测定

由于LPHNPs 外层壳层属于柔性结构，不适合采用高速离心法、超滤法等强烈机械力涉及的方法，因此，本项目中采用葡聚糖凝胶柱法[11]进行包封率测定。

2.4.1 芍药苷HPLC 测定条件

① 色谱条件：C18色谱柱，以乙腈-0.1% 磷酸溶液（14∶86）为流动相，检测波长为230 mm，进样量10 μL，柱温为30℃。

② 线性关系考察：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL 含60 μg 的溶液，作为母液。精密吸取适量芍药苷母液配制成质量浓度为4.12、6.18、8.24、12.36、16.48、20.6 μg·mL－1的系列标准工作液，进样分析，以峰面积对进样量回归分析作图，得到芍药苷标准曲线为Y＝1.024×104X＋368.3，r＝0.9997，表明进样量在0.0206 ～0.206 μg 与峰面积呈现良好的线性关系。

③ 洗脱液测定样品处理方法：收集包封率样品于玻璃试管中，加入3 倍量二氯甲烷，涡旋混合1 min，待分层彻底后，分离下层水层，再加入3 倍量二氯甲烷，同法萃取后，弃去二氯甲烷层，水层采用0.22 μm 针孔滤器滤过，续滤液进行含量测定分析。

2.4.2 葡聚糖凝胶柱洗脱曲线建立 称取适量葡聚糖G-50 作为固定相，溶胀好之后湿法填入10 mL 一次性注射器，洗脱约10 个柱体积后，移液器吸取上样液0.5 mL，轻轻上样至凝胶柱顶部，以纯化水洗脱，1.5 mL EP 管依次接取洗脱液，每0.5 mL 一管，采用“2.4.1”项下色谱条件测定样本浓度，以样品管编号为横坐标，以芍药苷浓度为纵坐标作图，分别绘制Pae 游离药物及GA-LPHNPS-Pae 洗脱曲线，见图3。纳米粒子在7 ～14 管被首先洗出，游离药物在17 ～31 管洗出，粒子和游离药物基本达到分离。

图3 GA-LPHNPs-Pae 葡聚糖凝胶柱分离洗脱曲线Fig 3 Elution curve of gel column separation of GA-LPHNPs-Pae

2.4.3 包封率测定

① 总药物量：取0.5 mLGA-LPHNPs-Pae 分散液，稀释至线性范围内，进样测定，通过Pae标准曲线计算其中所含有的Pae 药物质量作为总药量WT。

② 包封药量：收集GA-LPHNPs-Pae 分散液，上样洗脱第7 ～14 管样本测定，通过Pae 标准曲线计算其中所含有的Pae 药物质量作为包封药量，记为WE。

③ 包封率测定样品制备：收集包封率样品于玻璃试管中，加入3 倍量二氯甲烷，涡旋混合1 min，待分层彻底后，分离下层水层，再加入3倍量二氯甲烷，同法萃取后，弃去二氯甲烷层，水层采用0.22 μm 针孔滤器滤过，续滤液进行含量测定分析，根据以下公式计算包封率：

包封率＝We/Wt×100%[注：We为包封的药物的质量（mg），Wt为体系中药物总质量]。

测定3 批GA-LPHNPs-Pae 包封率结果分别为41.6%、52.3%、48.6%，平均包封率为（47.5±5.4）%。

2.5 GA-LPHNPs-Pae 释放度测定

取各组聚合物纳米粒1 mL，加入到3kD透析袋中，置于40 mL pH 7.4 PBS，再置于（37±0.5）℃恒温震荡摇床中，分别于0、2、4、8、12、24、36、48、72 h 取样2 mL，同时补给等体积的释放介质。使用HPLC 法测定样品溶液中芍药苷的含量，计算释放度，并绘制累积释放曲线，见图4。

图4 GA-LPHNPs-Pae 体外释放度Fig 4 In vitro drug release of Pae in GA-LPHNPs

由图4 可知，在24 h 内GA-LPHNPs-Pae 中芍药苷释放呈现先快后慢趋势，在前2 h 内，GALPHNPs-Pae 可释放出约50%药量，在2 ～12 h内释放速度显著下降，曲线平缓，12 h 后释放曲线基本平衡，但绝对药量并未达到100%释放。基于LPHNPs 的核-壳结构推测，在前2 h 快速释放的，可能在初期释放的是外脂质层包封的药物，内核聚合物材料中药物则释放较缓慢。

2.6 GA-LPHNPs-Pae 体外靶向性评价[12]

2.6.1 孵化时间的考察 以FITC 为荧光探针，与芍药苷一起载入NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae中，制备带荧光的纳米粒样品，葡聚糖凝胶柱纯化后冷冻干燥，用HBSS 充分溶解至药物当量为50 μg·mL－1。

HepG2 细胞以1×105个·cm－2密度接种于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，于24 孔培养板中培养24 ～48 h。细胞用HBSS 溶液预先孵育15 min后，每孔加入0.5 mL，放入培养箱中分别孵育1、2、4 h，考察孵化时间对结果影响。孵育结束后，吸弃纳米粒溶液，PBS 冲洗3 次，取出玻片放入4%多聚甲醛中，于室温固定20 min，PBS 漂洗3次，DAPI 染色10 min，以磷酸甘油封片，以不加纳米粒的细胞为空白对照，激光共聚焦观察。结果如图5（其中蓝色为细胞核颜色，绿色为FITC荧光颜色）。GA-LPHNPs-Pae 可被HepG2 细胞摄取，且胞内荧光强度2 h 较1 h 明显增强，4 h 与2 h 相比略弱。因此，确定孵化时间为2 h。

图5 两种纳米粒孵育HepG2 细胞不同时间的摄入情况Fig 5 Uptake of two nanoparticles incubating HepG2 cells at different times

2.6.2 细胞摄取纳米粒的定性观察 取50 μg·mL－1的NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 分 散液，按照“2.6.1”项下方法孵化2 h 后进行细胞摄取定性考察，结果如图6 所示。在2 h 时间点GA-LPHNPs-Pae 组荧光强度明显大于NPs-Pae，表明GA-LPHNPs-Pae 较未修饰的NPs-Pae 更易于被肝细胞摄取，从体外细胞模型中验证了GALPHNPs-Pae 的肝靶向性。

图6 两种纳米粒孵育2 h HepG2 细胞摄取定性Fig 6 Uptake characterization of two nanoparticles incubating HepG2 cells for 2 h

3 讨论

在GA-LPHNPs-Pae 处方优化时候发现，水溶性药物在GA-LPHNPs 递药系统中载药有限，整体包封率效率未达到80%，原因可能是因为Pae 水溶性很强，与有机聚合物材料亲和性不强导致[13-14]。对纳米粒乳化体系筛选、工艺优化反复摸索，最终确定本研究中所用的聚合物材料乳化体系，所得到最优包封率在50%。通过本项目的实施发现，聚合物纳米粒构建过程中，不同药物在不同乳化体系、不同聚合物材料中的物理化学相容性对于处方优化非常重要，因此针对此方向开展的工作具有很好的应用价值。

对于GA-LPHNPs-Pae 中药物包封率的测定也是一个值得探索的问题。通常纳米材料包封率测定方法有葡聚糖凝胶柱法、超滤离心法、高速离心法[15-16]。对于聚合物纳米粒可选用超滤离心法或高速离心法，而脂质体由于其结构柔软性则多采用葡聚糖凝胶柱法，脂质聚合物杂化纳米粒集合了聚合物纳米粒的硬度和脂质体的柔软性，在实验中综合考虑采用了葡聚糖凝胶柱法，以防止破坏壳-核结构[17-19]。

本文制备了GA-LPHNPs-Pae，并对其药剂学性质进行了初步理化评价，在体外采用细胞模型进行了初步靶向性评价，本课题研究的脂质聚合物杂化纳米粒是一个复杂体系，分为内外两部分：内核的载药PEG-PLGA 聚合物纳米粒是经复乳法制得，壳层经水化法包被带GA 修饰的磷脂（GADSPE-PEG）[20]，目前暂未对GA 的表面修饰进行详细的研究，但课题组认为通过后续的细胞靶向摄取结果也可以间接证实GA 的表面修饰，并且会进一步有效证明靶向修饰[21]。在今后的研究中，本课题组将继续对GA-LPHNPs-Pae 的体内靶向性进行验证，为新型肝靶向药物开发奠定基础。