槲皮素通过调节AhR和Nrf2通路对HepG2细胞中药物代谢酶GSTP1的影响

陈琪，刘婷婷，白图雅，2，3，张梦迪，2，3*，胡玉霞，2，3，李君，2，3，常福厚，2，3*（.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 000；2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 000；3.内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，呼和浩特 000）

药物代谢酶在人体维持正常生理活动中发挥重要功能，比如摄入的药物、食物等大部分物质是通过药物代谢酶代谢后排出人体的，药物代谢酶分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ相[1]。其中细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）属于单氧酶的一类，在许多药物代谢中起着关键作用，常见的Ⅰ相酶（CYP1A1、CYP1A2 和CYP1B1 等）将疏水化合物转化为亲水性发挥排毒过程；Ⅱ相酶，如谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferases，GSTS），NAD（P）H：醌氧化还原酶-1 [NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]，UDP-葡糖醛阳糖基转移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTS）和血红素氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1），可以催化结合反应，使结合产物灭活，并增加代谢产物的水溶性以利于排泄；Ⅲ相酶系统由各种ATP 结合（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白家族组成，参与排除药物和异生物质及其代谢物[2]。代谢酶的不同活性状态对抗肿瘤药物有效性的影响非常重要，明确代谢酶在摄入药物或者食物后的状态是保证药物活性的前提，本文欲探究天然植物中富含的槲皮素对谷胱甘肽-S-转移酶P1（glutathione-S-transferase P1，GSTP1）的具体影响及机制。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种配体依赖性转录因子，与芳烃核转运蛋白（aryl hydrocarbon nuclear translocator，ARNT） 作为核伴侣蛋白形成异二聚体后，调节几种药物代谢酶的表达。这种 AhR/ARNT 复合物与二噁英或异生物质反应元件（dioxin or xenobiotic responsive element，DRE/XRE）的特定 DNA 序列结合，导致Ⅰ相酶和Ⅱ相酶的相邻基因的转录激活，以及Ⅲ 期转运蛋白，如多药耐药蛋白及相关蛋白的激活[3]。研究表明，AhR 还调节核转录E2 相关因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的表达[4]。细胞在受到氧化应激刺激后，Nrf2 逃离KELCH 样ECH 关联蛋白1（kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）介导的蛋白体降解并转移至细胞核中。在细胞核中，Nrf2 与小Maf 蛋白形成异二聚体，复合物再与ARE 结合并诱导Nrf2 依赖性药物代谢基因，包括 NQO1、UGT 和GST[5]。因此，AhR 通过Nrf2 途径直接或间接调节药物代谢酶的表达。

槲皮素（quercetin）为黄酮类化合物，具抗肿瘤、抗氧化、保护心血管等多种药理作用[6]，抗肝癌活性尤为显著，可以阻滞肝癌细胞周期，抑制肝癌细胞生长，具有显著的抗肿瘤活性[7]。其抗肿瘤和化学预防特性可能是由于不同机制，包括自由基清除，改变信号转导通路，诱导凋亡，抑制Ⅰ相酶对致癌物质的代谢和诱导Ⅱ相酶对致癌物质解毒。其中槲皮素在不同类型细胞中均可激活Nrf2-ARE 信号通路[8-9]。对GSTP1 表达的影响及对活性氧（reactive oxygen species，ROS）和电亲物种的生物转化特别有益。但具体的抗肿瘤机制目前尚未完全明确[10]，同时槲皮素以GSTP1为靶点发挥抗肝癌的作用机制也未阐明。本研究主要验证槲皮素影响HepG2 细胞GSTP1 表达及分子机制，对今后槲皮素抗肝癌机制研究奠定理论基础，为肝癌预防和诊治方面提供新思路。

1 材料

1.1 细胞与试药

人肝癌细胞株（HepG2）、抗体AhR（ab190797）、CYP1A1（ab235185）、Nrf2（ab62352）、NQO1（ab80588）、GSTP1（ab138491）、β-actin 抗体（英国Abcam），RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天），总RNA 提取试剂盒（TIANGEN），AhR 抑制剂（CH-223191）、Nrf2 抑制剂（ML-385）、槲皮素（B20527）（上海源叶有限公司），MTT、青霉素、链霉素、胰酶、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma 公司），Nuclear Extraction Kit（美国Thermo 公司），Rever Tra Ace q PCR RT Kit、SYBR Green 试剂盒（日本TOYOBO 公司），RNA simple Total RNA Kit（北京天根生化科技有限责任公司），DMEM 高糖培养基（美国Gibco 公司）。

1.2 仪器

倒置生物显微镜（BDS200，德国Leica 公司），垂直电泳仪（HE99X-15-1.5，美国Hoefer 公司），台式高性能离心机（ST16R，德国Leica 公司），金属浴（OSE-DB-01，北京天根生化科技有限责任公司），二氧化碳培养箱（Heraeus HERA cell 150i，美国 Thermo Fisher 公司），多模式微孔板检测仪（Multiskan Mk3，Perkin Elimer 公司），－80℃超低温冰箱、荧光实时定量PCR 仪（Thermo-Forma-702，美国Thermo Fisher 公司），超微量核酸蛋白测定仪（ND2000C，Nanodrop 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

将人肝癌细胞系HepG2 置于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，在5% CO2、37℃恒温培养箱中进行贴壁培养，待细胞增殖至对数期，用胰蛋白酶进行消化，传代。

2.2 槲皮素对细胞活力影响

取HepG2 细胞接种96 孔板培养24 h 后，不同浓度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）继续培养24 h，取出培养基后向细胞中加入含有0.5 mg·mL－1MTT 试剂，37℃孵育4 h，吸出MTT加入150 μL DMSO 震荡摇匀10 min，570 nm 处测量吸光度，计算细胞增殖率。

2.3 核蛋白提取

取HepG2 细胞接种于6 孔板，采取不同浓度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）处理后，按照核蛋白提取试剂盒（ab78833）提取核蛋白。

2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测mRNA表达

取HepG2 细胞接种于6 孔板，分为对照组，槲皮素组（40 μmol·L－1），Nrf2 抑制组（1 μmol·L－1），槲皮素＋Nrf2 抑制组，观察槲皮素通过Nrf2 对GSTP1 的影响。另将细胞分为对照组，槲皮素组（40 μmol·L－1），AhR 抑制组（1 μmol·L－1），槲皮素＋AhR 抑制组，观察槲皮素通过AhR 对GSTP1 的影响。收集各组细胞，按照TRIzol 说明书裂解细胞，使用氯仿提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA 样品的OD260/OD280值，并进行定量。反转录引物见表1，扩增条件为：94℃ 5 min，92℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，32 个循环。反应结束后，PCR 仪器自动生成标准曲线和扩增曲线，所得结果直接在荧光定量操作系统中进行比较分析，目标基因的相对定量用2－ΔΔCT计算。

表1 基因引物序列信息Tab 1 Gene primer sequence information

2.5 Western blot 检测相关蛋白表达

收集药物作用后细胞，离心和裂解收集后用BCA 方法测定蛋白浓度。取等量的蛋白质，SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白条带印迹到硝酸纤维素膜上，封闭缓冲液中培养，相应一抗在4℃的封闭缓冲液中孵育过夜，室温下进行二次抗体培养1 h，采用增强化学发光法检测蛋白质，采用Image J 软件统计相对灰度值。

2.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 25.0 软件分析，符合正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较进行单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素对GSTP1 表达的影响

不同浓度槲皮素对HepG2 活力影响如图1A 所示，当浓度达到80 μmol·L－1时对细胞增殖有抑制作用（P＜0.01）。不同浓度的槲皮素对GSTP1的表达影响如图1B 所示，与对照组相比，不同浓度槲皮素组GSTP1mRNA 表达升高（P＜0.001），蛋白表达与基因水平结果一致，如图1C、1D。根据上述结果选取槲皮素40 μmol·L－1的剂量作为后续研究分子机制的药物浓度。

图1 槲皮素对HepG2 活力及GSTP1 表达的影响Fig 1 Effect of quercetin on the vitality of HepG2 cells and the expression of GSTP1

3.2 槲皮素通过Nrf2 对GSTP1 的影响

槲皮素通过Nrf2 对GSTP1 的影响如图2所示。与对照组相比，槲皮素组Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表达升高（P＜0.001），Nrf2 抑制剂组Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表达差异无统计学意义。Nrf2 属于核转录因子，单独添加抑制剂并不影响Nrf2 表达。与槲皮素组相比，槲皮素＋Nrf2 抑制剂组Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表达下降（P＜0.001）。蛋白表达与基因水平结果一致，说明槲皮素可以通过 Nrf2 激活GSTP1 的表达。

图2 槲皮素通过Nrf2 对GSTP1 基因和蛋白表达的影响Fig 2 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via Nrf2

3.3 槲皮素对Nrf2 核易位影响

如图3 所示，随着槲皮素浓度的升高，Nrf2从胞浆转移到细胞核增多，说明槲皮素可以促进Nrf2 核转录活性，通过Nrf2 直接影响GSTP1 的表达。

图3 不同浓度槲皮素对Nrf2 核易位的影响Fig 3 Effect of quercetin at different concentrations on Nrf2 nuclear translocation

3.4 槲皮素通过AhR 对GSTP1 的影响

槲皮素通过AhR 对GSTP1 的影响如图4 所示。与对照组相比，槲皮素组的AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表达升高（P＜0.01，P＜0.001），AhR 抑制剂组AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表达差异无统计学意义。由于AhR 为芳香烃受体，属于受体蛋白，单独添加抑制剂不会影响AhR及下游CYP1A1、GSTP1 的表达。与槲皮素组相比，槲皮素＋AhR 抑制剂组AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表达降低（P＜0.01，P＜0.001）。表明槲皮素可以通过激动AhR 信号通路进而影响GSTP1mRNA 的表达。AhR 与GSTP1 蛋白表达与基因水平一致。而CYP1A1 在蛋白水平差异无统计学意义，可能因为槲皮素作为AhR 低亲和力配体低浓度时仅促进下游mRNA 转录水平，在翻译过程可能受其他因素的干扰，导致CYP1A1 蛋白表达无明显变化（见图4）。

图4 槲皮素通过AhR 对GSTP1 基因和蛋白表达的影响Fig 4 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via AhR

4 结论

天然植物富含抗氧化和抗肿瘤的活性，大多与类黄酮的含量相关，此类物质可以调节药物代谢酶活性[11]，故明确类黄酮对代谢酶的影响是研究黄酮类物质抗肿瘤机制必不可少的过程。本研究主要探讨了槲皮素对GSTP1 代谢酶的调节作用，首先给予安全剂量范围的槲皮素，GSTP1 以及AhR 下游CYP1A1 均有所上调（P＜0.01），阻断AhR 后则下调（P＜0.01），证明了槲皮素可以通过AhR 信号通路影响GSTP1 的表达；同时还通过核转录实验证明槲皮素可以通过Nrf2直接影响GSTP1 的表达，同样Nrf2 相关信号通路标记物NQO1 在给予槲皮素刺激后表达上调（P＜0.01），给予Nrf2 阻断剂后GSTP1 表达下降（P＜0.01）。这些结果均证明槲皮素可通过AhR 及Nrf2 信号通路激动GSTP1 的表达。

目前GSTs 被分为7 个亚型，分别为alpha（α）、pi（π）、mu（μ）、theta（θ）、omega（ω）、sigma（σ）和zeta[12]，这些同工酶参与了通过谷胱甘肽结合的外源性药物的Ⅱ期解毒反应[13-14]，这在致癌物解毒和抗肿瘤药物代谢过程中起到重要作用。它们可以通过结合活性化合物或药物直接影响过度氧化或烷基化药物的理化性质[15]。同时GST 酶在化疗药物的解毒中也发挥着重要作用[16]。有些药物（如环磷酰胺）需要代谢酶转化为强效烷化剂才能发挥细胞毒性作用，但同时需要代谢酶转化为易排泄的复合物才可以消除毒副作用[17]。此外GST 的多态性与氟尿嘧啶和铂为基础的化疗化合物药效相关[18-19]，因此GST 家族成员在保证药效及排泄解毒方面发挥重要的作用。

GSTP1 是GST 家族中研究最多的成员[20]。GSTP1基因位于染色体11q13 上，由9 个外显子组成，长度为3.2 kb。GSTP1 具有广泛的生理功能：参与代谢、解毒和消除潜在基因毒性异物复合物，代谢多种致癌化合物，保护细胞免受DNA 损伤和癌变。体现在细胞中的功能包括亲电化合物的催化和脱氧、氧化应激调节、细胞信号传导[21-22]。GSTP1 能有效地保护细胞免受致癌物和亲电化合物的伤害[23-24]。在前列腺癌中普遍存在的GSTP1 的表观遗传沉默机制导致细胞长期氧化损伤后的存活率改变，表明GSTP1 具有保护和抗肿瘤功能[25]。GSTP1 还能缩短As2O3在细胞中的滞留时间。GSTP1 的分解代谢功能降低了细胞中As2O3的含量，从而阻断As2O3诱导的细胞凋亡[26]。此外，GSTP1 还参与了烟草中致癌物的消除过程，且在正常细胞和癌细胞中都发挥着清除有毒物质的作用[27]。GSTP1 还参与保护细胞免受氧化剂诱导的DNA 损伤[28]，阻止脂多糖诱导的促炎因子过度产生，并具有抗炎作用[29]。总之，GSTP1 作为一种药物代谢酶，在解毒、抗氧化及维持抗肿瘤药物的活性中发挥着重要作用，机体需要保持一定含量及稳态的GSTP1 以维持机体的健康运转。

本研究分析表明，槲皮素可以激动HepG2 细胞中GSTP1 的表达，其通过激动AhR 及Nrf2 信号通路进而改变GSTP1 的表达，这可以从AhR的下游CYP1A1 的表达被槲皮素激活所证实，Nrf2 的下游NQO1 同样被槲皮素激动，虽然激活能力不一致，但对照已发表的研究表明，槲皮素产生的对抗氧化应激的保护趋势一致[30-32]。总之，槲皮素可以激活HepG2 细胞中的AhR 和Nrf2信号通路，并且通过AhR 和Nrf2 信号通路调节GSTP1 的表达，这对理解槲皮素通过调节肝药酶的活性进而发挥解毒抗氧化作用具有重要意义。