响应面法优化醋炙延胡索炮制工艺研究

暴慧军，李沁（.河南省直第三人民医院 药剂科，郑州 450006；.河南中医药大学 药学院，郑州 450008）

延胡索为罂粟壳植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎，有活血、行气、止痛等功效，可用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌打肿痛等症[1]。其主要成分为具有镇痛作用的生物碱类，此外还含有抗菌抗炎作用的挥发油、多糖类等成分[2-4]。延胡索的不同炮制品均有镇痛抗炎作用，其中以醋炙为佳，现临床上多选用醋炙延胡索[5]。在临床使用过程中，中药临床疗效的好坏与其炮制工艺是否得当密切相关[6]，随着中药饮片使用率的逐年增加，传统的中药炮制工艺已无法满足市场要求[7]，现代化的炒药设备大量投入使用，但中药饮片的相关炮制标准目前仍无法制定，现多依靠从事炮制工作的工人根据经验对炮制辅料、温度、时间、炮制终点等进行判断，人为的判断标准个体化差异较大，炮制工艺无法标准化[8-9]。基于此，本研究以总生物碱、延胡索乙素、原阿片碱和挥发油含量及外观性状为指标，采用Box-Behnken 响应面法和综合评分法考察辅料用量、炒制温度、炒制时间对延胡索醋炙炮制工艺的影响进行相关研究，以期为延胡索醋炙炮制工艺的标准化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

CY-25 炒药机（温州顶历医疗器械有限公司）；HZT-B6000 电子天平（华志电子科技有限公司）；BSA224S-CW 电子天平、电子天平CP225D（德国赛多利斯）；Thermo Evolution201 紫外-可见分光光度计（赛默飞世尔科技）；1260Agilent 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；18120 纯水装置（上海摩勒科学仪器有限公司）；LXJ-ⅡB 飞鸽台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZF-6126LG 真空干燥箱（上海齐欣实业有限公司医疗设备厂）；DHG-9246A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；PHSJ-3F PH 计（上海创益仪器仪表有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）。

1.2 试药

延胡索（批号：190214，安徽人民中药饮片有限公司，经河南中医药大学第一附属医院药学部王宏贤副主任中药师鉴定符合《中国药典》2020年版一部相关规定）；米醋（广东厨邦食品有限公司）；延胡索乙素（批号：Y21S7Y17091）、原阿片碱（批号：Y12J10L90499）（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥ 98%）。甲醇、磷酸、三乙胺为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总生物碱含量测定[10]

2.1.1 溶液的制备

① 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，精密称定，加入无水乙醇，制成含延胡索乙素86 μg·mL－1的对照品溶液。

② 供试品溶液的制备：取延胡索粉末1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入60%的乙醇20 mL 加热回流提取两次，每次1.5 h，过滤，合并滤液并挥干，滴加稀盐酸调pH 值为2，每次加入10 mL 三氯甲烷萃取，萃取两次，滴加氨水调pH 值为11，再加入8 mL 超纯水洗涤，将下层三氯甲烷溶液放出后，在蒸发皿中挥干三氯甲烷，加入无水乙醇溶解，定容于50 mL 的量瓶中，即得供试品溶液。

2.1.2 测定波长的确定 取“2.1.1”项下对照品和供试品溶液各1.5 mL，加入无水乙醇定容于10 mL 的量瓶中，以无水乙醇溶液为空白对照，在波长200 ～400 nm 处，进行扫描，对照品和供试品溶液在280 nm 处有最大吸收，因此确定延胡索总生物碱的测定波长为280 nm。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取延胡索乙素对照品溶液0.7、2、3、4、7、9 mL，置于10 mL量瓶中加入无水乙醇定容，于280 nm 处测定吸光度，以对照品溶液的质量浓度（μg·mL－1）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A＝0.0123C＋0.0773，R²＝0.9998，延胡索乙素在6.02 ～77.4 μg·mL－1内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 方法学考察 分别对延胡索乙素的精密度、重复性、稳定性及加样回收率进行考察，所得的胡索乙素的精密度、重复性、稳定性RSD值分别为0.16%、2.9%、2.1%，平均加样回收率为98.6%，RSD值为2.3%，表明该方法精密度、重复性、稳定性及加样回收率良好。

2.2 延胡索乙素和原阿片碱的含量测定[11-12]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶45），三乙胺调pH 至6.0；流速：1.0 mL·min－1；检测波长280 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

2.2.2 溶液的制备[13]

① 对照品溶液的制备：取延胡索乙素和原阿片碱对照品适量，精密称定，置于25 mL 的量瓶中加入甲醇溶解并定容，制成含延胡索乙素126.0 μg·mL－1、原阿片碱135.2 μg·mL－1的混合对照品溶液。

② 供试品溶液的制备：取延胡索不同炮制品粉末0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇-浓氨水溶液（20∶1）25 mL，称定质量，将锥形瓶放入冷水中，冷浸1 h，加热回流1 h，冷却至室温，用甲醇-浓氨水溶液补足减少质量，振摇、过滤，滤渣用甲醇冲洗并过滤，合并滤液，置于蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解置于5 mL 的量瓶中，定容，即得。进样前用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，进样，测定，记录色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A）and sample（B）

2.2.3 标准曲线绘制 精密吸取“2.2.2”项下延胡索乙素与原阿片碱混合对照品溶液1、2、3、5、7、10 mL，分别置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，配制成延胡索乙素质量浓度为12.6、25.2、37.8、63、88.2、126.0 μg·mL－1，原阿片碱质量浓度为13.5、27.0、40.6、67.6、94.6、135.2 μg·mL－1的系列混合对照品溶液，进样测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程及线性范围分别为：延胡索乙素Y＝9.679X＋10.15（r＝0.9999），12.6 ～126.0 μg·mL－1；原阿片碱Y＝10.20X＋3.796（r＝0.9999），13.5 ～135.2 μg·mL－1。

2.2.4 方法学考察 分别对延胡索乙素、原阿片碱的精密度、重复性、稳定性及加样回收率进行考察，所得延胡索乙素的精密度、重复性、稳定性RSD值分别为0.32%、1.2%、1.4%，平均加样回收率为96.50%，RSD值为1.0%；原阿片碱的精密度、重复性、稳定性RSD值分别为0.79%、1.3%、1.3%，平均加样回收率为97.75%，RSD值为2.0%。表明该方法的精密度、重复性、稳定性及加样回收率良好。

2.3 延胡索醋炙炮制工艺设计

2.3.1 试验设计 根据《中国药典》2020年版四部炮制通则规定，醋炙法的辅料量为每100 kg 药材加米醋量为20 kg，文火炒；基于此规定本试验将辅料用量控制在10 ～30 kg，文火温度调节为110 ～150℃，炒制时间设置为5 ～15 min，确定辅料用量、炒制温度、炒制时间三个因素为自变量，以总生物碱、延胡索乙素、原阿片碱含量和外观性状指标为效应值。根据Box-Behnken 试验设计原理[14]和多指标综合评分法[15]，采用三因素三水平进行分析，试验设计因素及水平见表1。

表1 因素与水平Tab 1 Factor and level

2.3.2 综合评分法优化醋延胡索炮制工艺 挥发油含量测定[1，16]采用《中国药典》2020年版四部通则挥发油测定法进行测定，测定结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Tab 2 Design and results of response surface

外观性状以片型整齐、闷润透，饮片颜色均匀，表面黄色或黄褐色，角质样，具蜡样光泽，略有醋香气为佳，总分计为10 分。

用多指标试验的综合评分公式，对效应面试验结果进行分析。总生物碱的最高量计为 20 分，延胡索乙素的最高量计为20 分，原阿片碱的最高量计为20 分，挥发油含量的最高量计为20 分，外观性状的最高评分计为 20 分，各样品分别计算综合评分值，分析结果见表2。

综合评分Y＝（X1/X1max）×20 ＋（X2/X2max）×20 ＋（X3/X3max）×20 ＋（X4/X4max）×20 ＋（X5/X5max）×20，其中X1为总生物碱的量，X2为延胡索乙素的量，X3为原阿片碱的量，X4为挥发油含量，X5为外观性状评分值，响应面分析结果见表2，方差分析结果见表3。

以综合评分为效应值，采用Design Expert 8.0 软件对试验结果进行回归分析，得到经拟合后的回归模型方程为：Y＝89.81 ＋4.54A＋3.14B－2.24C＋1.85AB－0.54AC－0.17BC－6.60A2－6.67B2－1.90C2。由表3 可知，该模型P＜0.0001，有很好的显著性，且失拟程度P＝0.0582 ＞0.05，不显著，表明该模型能够较好地反映辅料用量（A）、炒制温度（B）、炒制时间（C）与总生物碱、延胡索乙素、原阿片碱、总挥发油、外观性状含量之间的变化关系，可用来对该炮制工艺进行分析和预测；根据方差分析结果可知，试验因素A、B、C、AB、A2、B2、C2项的P值均＜0.05，说明该项对综合评分均有显著影响，且单因素对综合评分的结果大于交互项。

表3 方差分析结果Tab 3 ANOVA results

效应面优化和预测根据回归模型方程，将闷润时间、炒制温度和炒制时间对总评分的影响绘制成效应面图2；根据模型分析结果及相应的效应面图和等高线图，得到醋炙延胡索炮制的最佳工艺条件为：辅料用量24.13 kg，炮制温度136.01℃，炮制时间6.67 min。

图2 各因素交互作用对综合评分影响的响应曲面图Fig 2 Response surface of interactive effect on the comprehensive score

2.3.3 工艺验证 根据试验结果再结合实际操作的可行性，将最佳炮制工艺调整为：辅料用量24 kg，炒制温度135℃，炒制时间7 min。取6 份生品延胡索，按照以上工艺炮制成醋延胡索饮片，分别测定每份炮制品中的总生物碱、延胡索乙素、原阿片碱、总挥发油含量，并对其外观性状进行评分，最终所得综合评分的均值为92.03，RSD值为1.4%，与理论预测值91.96 相近，表明该炮制工艺合理可行。

2.3.4 炮制工艺参数与各评价指标相关性分析通过对醋炙延胡索的炮制工艺优化，依照醋炙延胡索炮制工艺参数以及各评价指标，利用SPSS 22.0 软件[17]列出相关系数矩阵，依据 Pearson 系数进行相关性检验，具体结果见表4。

表4 炮制工艺与各评价指标相关性分析Tab 4 Correlation of process technology and evaluation index

根据相关性分析结果可知，辅料用量与总生物碱含量和外观性状成显著正相关；炮制温度与原阿片碱含量成显著正相关，与总挥发油含量成负相关；总生物碱含量与外观性状和综合评分成显著正相关；延胡索乙素含量与原阿片碱和综合评分成显著正相关，与总挥发油含量成显著负相关；原阿片碱与总挥发油成显著负相关；外观性状与综合评分成显著正相关。

3 讨论与结论

本试验通过多指标综合评分法及响应面法对醋炙延胡索炮制工艺进行优化，最终优化出的最佳炮制工艺为辅料用量24 kg，炒制温度135℃，炒制时间7 min。通过对炮制工艺参数及各评价指标的相关性进行分析，各炮制工艺参数并非与所有的评价指标均有显著相关性，但综合评分与总生物碱含量、延胡索乙素及外观性状成显著正相关，可为后期优化评价指标提供参考；另外炮制时间与各评价指标无显著相关性，受样本量小的影响，后期试验过程中需增加样本数量、批次等加以验证。

在中药炮制过程中，炮制工艺无统一标准，工艺参数差异较大，中药饮片生产工艺不稳定，导致饮片质量不可控，这些都会对中药的临床疗效产生巨大的影响[18-19]。以“整体观念”为切入点，增加除有效成分、外观性状以外的其他评价指标，如饮片本身的物理性质pH、膨胀度、黏度、脆碎度等，大分子物质淀粉、多糖、纤维含量等，将中药本身的形、色、气、味、质相融合[13]，作为炮制工艺评价的整体指标，为构建更为多元化的炮制中药饮片相关质量检验标准作出新尝试。