HPLC定性定量分析-模式识别研究沙棘银花颗粒提取工艺

华若辰，拓文静，宋自娟，刘建书，卢闻*（.西安交通大学医学部药学院，西安 7006；.陕西省功能食品工程技术研究中心，西安 70054）

中药提取是中成药及中药相关产品生产的重要工艺环节，优良的中药提取工艺可以降低成本，减少对环境的污染，提高提取效率。目前对于中药提取工艺的研究多采用正交[1-3]或均匀试验设计[4]，设置料液比、提取时间、提取次数等考察因素和水平，以浸膏得率和指标成分转移率为指标，评价和筛选提取工艺[5-6]。然而，中药来源广泛、组成复杂，容易造成产品执行生产时出现较大偏差，质量波动大，因此，建立较为全面的综合评价方法非常有必要。沙棘银花颗粒是由金银花、沙棘、甘草3种药食同源药材组成的中药组方。本文以提取溶剂种类、用量和提取时间为考察因素，结合HPLC 特征图谱定性分析、相似度分析、聚类分析及指标成分定量分析，建立一种沙棘银花颗粒提取工艺及过程研究的综合评价方法。

1 试药

维采宁-2（批号：HR1254W1）、异绿原酸B（批号：H1021136198）、芹糖甘草苷（批号：HR12311W2）（宝鸡市辰光生物科技有限公司，纯度均为98%）；槲皮素（批号：100081-200907，纯度：97.5%，中国食品药品检定研究院）；甘草、金银花、沙棘均购自北京同仁堂（西安小寨店，经西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为正品）。色谱甲醇（美国TEDIA 试剂公司）；试验用水为超纯蒸馏水（优普超纯水机制备）；其他分析纯试剂与试药购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

取维采宁-2、芹糖甘草苷、异绿原酸B 和槲皮素对照品，精密称定，甲醇溶解并制成维采宁-2、异绿原酸B 和槲皮素质量浓度均为100.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷质量浓度为1.00 mg·mL－1的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量置100 mL 量瓶中，甲醇稀释、定容，制得含维采宁-2 为2.0 μg·mL－1、异绿原酸B为3.0 μg·mL－1、槲皮素为1.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷为40.0 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

金银花、甘草、沙棘经粉碎后，称定金银花粗粉7.0 g、沙棘粗粉6.0 g、甘草粗粉3.0 g，置圆底烧瓶中，加入提取溶剂，称定质量，回流提取（提取溶剂种类、用量及提取时间见表1）。回流结束放至室温，称定质量，新鲜提取溶剂补足减失的质量，滤过，减压回收溶剂。浓缩至干，称定所得干膏质量。按如下公式计算浸膏得率：

表1 提取工艺参数Tab 1 Extraction process parameters

浸膏得率（%）＝浸膏量/生药投入量×100%

粉碎所得干膏，取适量，精密称定，置量瓶中，甲醇超声溶解，室温定容，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

应用LC-2030C 3D 高效液相色谱仪（SHIMADZU，Japan）和LC Solution 色谱工作站进行HPLC分析。色谱柱：Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）（美国Welch 公司）；流动相：0.02%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（见表2）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：维采宁-2 为339 nm，芹糖甘草苷为276 nm，异绿原酸B 为327 nm，槲皮素为304 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution program

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批（S2）供试品溶液，连续进样6 次，结果各共有峰相对保留时间RSD均小于1.5%，相对峰面积RSD均小于2.4%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批（S2）供试品粉末6份，精密称定，甲醇溶解定容，进样测定，结果各共有峰相对保留时间RSD均小于2.1%，相对峰面积RSD均小于2.7%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批（S2）供试品溶液，分别于0、4、8、12 和24 h 进样测定，结果各共有峰相对保留时间RSD均小于2.2%，相对峰面积RSD均小于2.9%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 HPLC 特征图谱建立

取各工艺所得样品（S1 ～S7），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图。将所得色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A，以S1 为参照图谱，中位数法生成7 组样品的对照特征图谱，通过多点校正和色谱峰匹配，确定20 个共有峰，HPLC 特征图谱叠加图见图1。以共有峰2 为参照峰，计算20 个共有峰的相对保留值，相对保留时间RSD均小于0.7%，而共有峰的相对峰面积RSD值波动较大，除参照峰2 外，跨度在11.5%～214.5%，可见峰面积受提取工艺影响较大。

图1 7 种工艺提取物HPLC 特征图谱叠加图（248 nm）Fig 1 HPLC characteristic chromatogram of extraction products from 7 extraction processes（248 nm）

2.6 相似度评价

利用指纹图谱相似度评价软件[7]进行相似度分析，结果表明，7 种工艺整体相似度高于0.80，其中醇提工艺S1 与S2 相似度大于0.99，水提工艺S3 ～S7 相似度均大于0.98，见表3。

表3 7 种工艺提取物相似度Tab 3 Similarity of 7 extraction processes

2.7 聚类分析

采用系统聚类分析法[8]对7 种工艺的色谱数据进一步分析，以保留时间为7.84 min 的2 号峰为参照峰，计算20 组共有峰的相对峰面积（见表4）。将20 组相对峰面积导入SPSS 23 软件，采用组间连接法，以欧式距离作为测度，得到水平方向上的聚类分析谱系图（见图2），观察7 种工艺之间的差异。聚类分析结果表明，当分类距离为25 时，醇提工艺（S1、S2）和水提工艺（S3、S4、S5、S6、S7）分别聚为一类；当分类距离小于20 时，水提工艺中的S7 单独为一小类，S3、S4、S5、S6 为另一小类。

表4 7 种工艺提取物HPLC 特征图谱共有峰的相对峰面积Tab 4 Relative area of HPLC characteristic chromatogram common peaks of 7 extraction processes

图2 7 种工艺聚类分析谱系图Fig 2 Cluster analysis diagram of fingerprint for 7 extraction processes

2.8 指标成分含量测定

定量分析了7 种工艺提取的浸膏得率和3 味药材中指标成分（维采宁-2、芹糖甘草苷、异绿原酸B 和槲皮素）含量（见图3），根据浸膏中指标成分含量计算生药中的指标成分含量，见表5。S4 ～S6 浸膏得率相近且较高；S1、S3 和S7 的浸膏得率相近且次之于S4 ～S6；S2 浸膏得率最低。以生药量为基准的指标成分含量比较，维采宁-2 以工艺S4 得率最高，S2 最低；芹糖甘草苷以工艺S1 得率最高，S7 最低；异绿原酸B 以工艺S4 得率最高，S1 最低；槲皮素含量以工艺S2 最高，S6 最低。综上分析可知，工艺S4 所得提取浸膏中维采宁-2 和异绿原酸B 成分含量为7 种工艺中最高；所得芹糖甘草苷和槲皮素含量仅次于工艺S1 和S2，但均高于工艺S3 以及S5 ～S7。

表5 浸膏得率及指标成分含量Tab 5 Extraction yield and principal component content

图3 指标成分HPLC 图Fig 3 HPLC fingerprint of principal components

3 讨论

中药指纹图谱是一种国内外广泛接受的中药质量评价模式，可以作为现代中药质量标准体系的核心技术和基石[9-10]。随着《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的推行实施，以及分析仪器和技术的不断更新，中药指纹图谱技术已应用到中药材及中药产品的生产、加工、贮存和流通各环节的质量监控[11-12]。然而，单一的指纹图谱分析在中药质量监控上显得不足，应用指纹图谱技术结合指标成分定量的评价方法逐渐成为主流[13-14]。近年来，指纹图谱结合化学模式识别的分析方法作为新的评价方法已应用到中药质量监控[15-16]。基于此，本文采用HPLC 特征图谱定性分析和指标成分定量分析，结合模式识别，对沙棘银花颗粒提取工艺进行了评价。

本文采用梯度洗脱程序和二极管阵列检测进行HPLC 图谱的共有峰识别和指标成分定量分析，运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析7 种工艺所得沙棘银花浸膏的特征图谱，并确定了20个共有峰。在此基础上，进行相似度及聚类分析，结果水提、醇提工艺分别聚为一类，可知提取溶剂是工艺差异的主要影响因素；而在水提工艺中，S3、S4、S5 和S6 的共有峰相对峰面积较为接近。综合浸膏得率和指标成分定量分析可知，工艺S4在7 种工艺中有相对高的成分转移率，即12 倍量水为提取溶剂，提取时间为2 h。

进一步分析考察因素的影响，不同提取溶剂工艺S1、S2 和S3（75%乙醇、95%乙醇和水），S1和S2 有较高相似度，而指标成分维采宁-2 和芹糖甘草苷以S1 转移率为高，指标成分异绿原酸B 以S3 转移率为高，槲皮素以S2 转移率为高；不同提取溶剂用量工艺S3、S7 和S5（8、12 和15 倍量），三者的相似度较高，指标成分维采宁-2、芹糖甘草苷和异绿原酸B 转移率以S5 为高；不同提取时间工艺S7、S4 和S6（1 h、2 h 和3 h），三者同样有较高的相似度，4 种指标成分以S4 转移率为高。

综上，本文以基本的提取工艺参数为考察，应用HPLC 特征图谱定性分析结合相似度、聚类分析和指标成分定量分析，对沙棘银花颗粒提取工艺进行了多指标的综合评价，可为指纹图谱技术在中药产品各环节的拓展应用提供参考。