济源市一起致泻大肠埃希菌引起食源性疾病的实验室检测及溯源分析

王军鹏 吕品品 刘 磊 济源市疾病预防控制中心（河南，济源，459000）

张广伟 河南省疾病预防控制中心（河南，郑州，450018）

致泻大肠埃希菌（diarrheagenic Escherichia coli，DEC）引起肠道感染致腹泻，与食入污染的食品和饮水有关，为外源性感染［1］。根据其致病机制不同，引起胃肠炎的DEC 分为5 种类型，即肠产肠毒素大肠埃希菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC），肠侵袭性大肠埃希菌（enteroinvasive E.coli，EIEC），肠致病性大肠埃希 菌 （enteropathogenic E.coli，EPEC），肠出血性大肠埃希菌 （enterohemorrhagic E.coli，EHEC）和肠聚集性大肠埃希菌 （eneteroaggregative E.coli，EAEC）。快速检测和鉴定病原菌是及时有效地控制与预防传染病传播的重要手段。DEC 的传统检测方法是分离培养、生化鉴定、血清学试验分型，该方法的缺陷是实验周期长，对DEC 尤其是生化非典型的菌株进行细菌鉴定时误检率和漏检率较高［2-3］。分子生物学方法以其检测速度快、敏感度高、特异性强等特点，已成为对病原菌快速鉴别与分型的重要技术之一，能准确检测出病原菌携带的毒力基因。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一体系里加上2 对或2 对以上引物，同时扩增出多个核苷酸片段的PCR 反应，一次反应可检出多种不同的毒力基因，因而扩大了检测范围并提高了检测速度［4］，且重复性好，稳定性强。PFGE 分型技术和多重PCR 检测可作为DEC 引起的食源性疾病诊断的参考依据。本分析呈现该事件实验室检测过程并对检测结果进行分析。

1 内容和方法

1.1 内容

1.1.1 病例定义

2020 年8 月20 日，济源市某酒店发生一起聚集性食源性疾病。中午参加婚宴共同进餐人数315人，截至21 日中午发病住院患者79 例。临床表现为首先出现轻微腹痛，相继发生恶心、腹泻等症状，呕吐症状较轻，腹泻一般3～10 次，多为水样便，并伴不同程度的低热（≤38.5 ℃）。全部患者1～3 d 痊愈，没有死亡病例出现。

1.1.2 样本采集

开展现场流行病学调查的同时，采集酒店中婚宴当天剩余的可疑食物及住院患者的腹泻物、肛拭子等进行实验室检测。采集菜品样品9 份（五香牛肉、大刀耳片、肘子、西芹桃仁、梅菜扣肉、烤鸡、千叶豆腐、红豆沙、熟鹌鹑蛋各1 份），砧板1 个，腹泻物10 份，肛拭子2 份，共计22 份样本，紧急送至济源市疾病预防控制中心进行检测。

1.1.3 培养基和试剂

培养基购于青岛海博生物技术有限公司和北京路桥技术股份有限公司，NID 鉴定卡购于美国BD公司，核酸提取试剂盒购于西安天隆科技有限公司，5 种致DEC 核酸多重实时荧光PCR 检测试剂盒购于北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，内切酶Xba I 购于日本TaKaRa 公司，标准菌株购于广东环凯生物有限公司。

1.1.4 检测仪器

苏静安泰BSC-1304II A2 型生物安全柜、北京光明SPX-150 型生化培养箱、BD PhoenixTM100 全自动微生物鉴定仪、西安天隆NP968 核酸提取仪、ABI QuantStudioTM7 Flex 荧光PCR 仪，BIO-RAD 脉冲场凝胶电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

结合现场流行病学调查，按照GB 4789.7—2013 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》、GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB 4789.10—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄葡萄球菌检验》、GB 4789.6—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》等标准进行致病菌分离及培养。

1.2.2 致病菌的分离与初步鉴定

将分离的可疑纯菌株用NID 鉴定卡经BD PhoenixTM100 全自动微生物鉴定仪进行初步生化鉴定，鉴定结果为大肠埃希菌。

1.2.3 细菌核酸提取

使用1 μL 接种环刮取营养琼脂平板上经BD PhoenixTM100 全自动微生物鉴定仪鉴定的可疑菌落，悬浮于200 μL 灭菌双蒸水中，充分打散制成浓度108～109CFU/mL 的菌悬液备用。按照西安天隆科技有限公司生产的细菌核酸提取试剂盒说明书要求，用NP968 全自动核酸提取仪进行核酸提取。取2 μL 核酸提取液做为模板。

1.2.4 5 种DEC 核酸多重实时荧光PCR 方法的建立

北京卓诚惠生生物科技股份有限公司出品的5种DEC 多重实时荧光PCR 检测试剂盒同样采用多重PCR 技术。对同一样本采用A、B、C 三种PCR 反应 体 系 对5 种DEC （EPEC、EHEC/STEC、ETEC、EIEC、EAEC）进行检测。A 管可用于EPEC 和EHEC/STEC 的检测，B 管可用于ETEC 和EIEC 的检测，C 管可用于EAEC 和大肠埃希菌种属的鉴定。通过收集PCR 扩增产生的荧光信号，确定待测样本是否含大肠埃希氏菌的同时，判定其致病型别。

将多重PCR 反应条件设定为：预变性95 ℃5 min，1 个循环；变性95 ℃15 s，退火/延伸60 ℃60 s，40 个循环。“Reporter Dye”分别设置为FAM、VIC、CY5 和ROX。“Quencher Dye”均为None。致病型别的判定标准如表1 所示。

表1 5 种DEC 毒力基因及型别判定标准

1.2.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

依照《食源性疾病PFGE 分子溯源标准操作程序》，对多重荧光PCR 检测阳性的DEC 进行PFGE检测。采用沙门菌Braenderup 血清型H9812 菌株为标准菌株，Xba I 酶切，作为Marker。BioNumerics 软件对PFGE 图谱进行聚类分析。不同基因型的判断按照菌种间相似性系数作为同一谱型划分依据［5］，按图谱相识系数≥85%表现为克隆关系的菌株，＜85%表现为无克隆关系［6］。

2 结果及分析

2.1 致病菌检测

采集病例腹泻物10 份、肛拭子2 份、剩余菜品等10 份，共计22 份样本中有5 份样本分离出菌株，经全自动细菌鉴定仪器和多重荧光PCR 检测，结果提示为DEC 阳性。其他致病菌均未检出。

2.2 毒力基因检测

从2 份菜品（五香牛肉、大刀耳片）和3 份病例腹泻物共计5 份样本中分离鉴定出EAEC 菌株18株，其毒力基因均为uidA（+）aggR（+）astA（+）pic（+），占100.0%。ETEC、EIEC、EPEC 和EHEC 均未检出。

2.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE 主要用于传染病的流行病学研究及细菌分子分型，疾病预防控制中心利用PFGE 验证传染病的暴发流行，追溯传染源及传播途径［7］。此次食源性疾病分离到的18 株EAEC 菌经PFGE 检测，采用BioNumerics 软件聚类分析。结果提示，食品、腹泻物样本分离的18 株菌株为同一PFGE 型别，同源性为100.0%。

3 讨论与分析

依据现场流行病学调查资料和实验室检测结果，可以确诊此次突发事件是因患者食用了粘附性大肠埃希菌（EAEC）污染的肉类凉菜而引起的食源性疾病。DEC 中的EAEC 感染后临床表现复杂多样，呈持续性水样腹泻，伴脱水，偶有血便［8］，低热，通常无腹痛，很少有呕吐，符合此次突发事件的临床特征。EAEC 所致人体感染与宿主易感性、宿主免疫反应、菌株毒力异质性以及感染者所摄入的菌量有关［9］。

建国以来，在我国的食源性疾病暴发事件中，致病原因不明的急性胃肠炎占20%左右［10-12］，且症状相似，病因多样。DEC 引起的食源性疾病鲜有报道，经典的实验室细菌检测用培养法，虽然可靠但耗时长［13］，而且不能有效地区分DEC 和非DEC，检验结果并不能作为是否有致病能力的依据，只能说某个血清型可能与致病相关。因此在传统检测方法的基础上，有必要进行大肠埃希菌的毒力基因检测。多重荧光PCR 检测具有特异性强、灵敏度高、效率高和成本低等特点，目前已广泛应用于食源性致病菌的检测。本次事件中，通过构建多重检测体系不仅可以确定可疑菌株是否为大肠埃希菌，还能判定其致病性，为DEC 的监控、检测及溯源等提供了参考依据。

PFGE 具有技术成本小、技术门槛低、可重复性高和实验室间比对性好等特点，在各类突发公共卫生事件（例如院内感染、食源性疾病暴发和细菌学传染病暴发）中得到广泛应用，成为目前细菌流行病学溯源研究的“金标准”［14］。本事件用PFGE 分型技术对分离的可疑DEC 进行分子分型与聚类分析，提示其同源性为100.0%。根据Tenover 等［5］的原则判定，从所采剩余凉菜和患者腹泻物中分离的菌株为同一PFGE 型。

应用分子生物学技术，致病菌溯源已进入生物信息时代，食源性致病菌的鉴定及事件溯源更多地通过基因型别、分子型别或全基因组测序方式获得更精准的结果［15］。在食源性疾病的溯源分析中，可结合多重PCR 技术和PFGE 分型技术，综合作为实验室确诊的参考判定依据，对事件的分析及判定更有意义，更能提高不明原因食源性疾病的诊断率，真正发挥实验室检测的技术支撑作用。