甲状腺乳头状癌组织PD⁃1和NLRP3表达与临床特征的关系

岳春艳 彭一 高春斌 霍占江

随着甲状腺癌发病的增加及相关认知的进展，关于甲状腺癌的分子机制受关注，相关药物开发和治疗也受到重视［1］。程序性死亡受体⁃1（Pro⁃grammed death receptor⁃1，PD⁃1）与甲状腺癌等肿瘤免疫逃逸均密切相关［2］。NOD 样受体家族蛋白3（NOD⁃like receptor protein，NLRP3）激活后可将人白介素1β（interleukin 1β，IL⁃1β）活化而参与炎症反应，与甲状腺滤泡癌预后密切相关［3］。本研究分析PD⁃1和NLRP3的mRNA 和蛋白表达水平状况及其对肿瘤直径、局部侵犯、TNM 分期等临床特征的影响，为进一步明确甲状腺乳头状癌发生发展机制及通过其PD⁃1 和NLRP3 相关通路干预进行甲状腺乳头状癌提供参考依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月至2021年8月于张家口市第一医院治疗且病理诊断为甲状腺乳头状癌患者124例为研究对象，收集患者的癌组织及配对癌旁组织标本进行研究。纳入标准：①经术后病理诊断为甲状腺乳头状癌［4］；②经手术治疗，术前未经其他外科手术处理；③检查完善且资料全。排除标准：①合并其他癌症或器官障碍患者、合并自身免疫性疾病患者；②前期经放化疗等抗癌治疗患者。其中1 例患者因合并肾功能低下排除，纳入的124 例甲状腺乳头状癌患者中，男57 例，女67 例，年龄平均（41.28±10.18）岁，肿瘤直径≥2 cm 患者53 例，肿瘤直径<2 cm 患者71 例，有局部侵犯（显微镜下显示包膜侵犯）患者55 例，无局部侵犯患者69 例，TNM 分期（美国癌症联合委员会第8 版甲状腺癌TNM 分期［5］）为Ⅰ～Ⅱ期患者52 例，TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期患者72 例。研究经本院伦理学委员会审核批准（伦理批号：2022019），且患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链式反应检测

采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测患者癌组织和癌旁组织PD⁃1 和NLRP3 的信使核糖核酸（messenger rib onucleic acid，mRNA）表达水平。常规从检测样本中提取总RNA，逆转录形成cDNA，行实时荧光定量聚合酶链式反应，反应体系如下：cDNA 1μL，双蒸水3.4 μL，qPCR Super⁃Mix 5 μL，被动参比染料（×50）0.2 μL，正向引物（10 μmol/L）0.2 μL，反向引物（10 μmol/L）0.2 μL，总体积10 μL。引物序列（上海生工生物科技有限公司合成产品）如下：PD⁃1 上游引物：5′⁃GC⁃GTGACTTCCACATGAGC⁃3′，PD⁃1 下游引物：5′⁃GCAGGCTCTCTTTGATCTGC⁃ 3′。NLRP3 上 游引物：5′ ⁃TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA⁃3′，NLRP3 下游引物：5′⁃AAGAGACCACGGCAGAA GCTAG⁃ 3′。β⁃actin 上游引物：5′ ⁃TCGCTGCGC TGGTCGTC⁃3′，β⁃actin 下游引物：5′⁃GGCCTCGT⁃CACCCACATAGGA⁃ 3′。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min，95℃变性20 s，56℃退火5 min，72℃延伸20 s，共35个循环后，72℃延伸10 min。PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量采用2⁃ΔΔCt法计算。

1.2.2 免疫组化检测

采用免疫组化法检测患者癌组织和癌旁组织PD⁃1 和NLRP3 的蛋白表达水平。组织标本常规石蜡包埋并制成厚度为4 μm 的连续切片，切片经烤片、脱蜡和水化后采用柠檬酸抗原修复液进行高压抗原修复，采用3%双氧水阻断过氧化氢酶的活性，添加PD⁃1 和NLRP3 一抗（美国Proteintech 公司）在20℃处理90 min，采用鼠/兔通用二抗在20℃处理半小时，行DAB 显色，显微镜下观察显色满意后采用去离子水终止显色，采用苏木精进行复染、盐酸乙醇进行分化，梯度酒精脱水后吹干后中性树胶封片。由2 名病理科医生采用双盲法进行阳性结果判读，光学显微镜下随机选取5 个视野，200 倍放大下进行观察，以黄色或棕黄色为染色阳性，PD⁃1 染色定位于细胞核，NLRP3 染色定位于细胞浆和细胞核，计算阳性细胞的百分率，阳性细胞百分率≥5%为阳性表达［2］。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。计量资料符合正态分布并以（）表示，比较采用t检验。采用Logistic 回归模型分析甲状腺乳头状癌患者临床特征影响因素。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺乳头状癌患者癌组织与癌旁组织中PD⁃1 和NLRP3 表达水平比较

甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于其癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

表1 甲状腺乳头状癌患者癌组织与癌旁组织中PD⁃1 和NLRP3 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of PD⁃1 and NLRP3 expression levels in cancer tissues and adjacent tissues of patients with papillary thyroid carcinoma（±s）

表1 甲状腺乳头状癌患者癌组织与癌旁组织中PD⁃1 和NLRP3 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of PD⁃1 and NLRP3 expression levels in cancer tissues and adjacent tissues of patients with papillary thyroid carcinoma（±s）

组织癌组织癌旁组织t/χ2值P 值n 124 124 mRNA PD⁃1 0.91±0.16 0.13±0.03 53.356<0.001 NLRP3 1.03±0.18 0.22±0.05 48.282<0.001蛋白阳性表达率PD⁃1 72(58.06)15(12.10)57.525<0.001 NLRP3 87(70.16)19(15.32)76.186<0.001

2.2 不同临床资料和临床特征患者癌组织中PD⁃1和NLRP3 表达比较

不同性别、年龄患者的癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义（P>0.05）。肿瘤直径≥2 cm 患者癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于肿瘤直径<2 cm 患者，有局部侵犯患者癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于无局部侵犯患者，TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期患者癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表2。

表2 不同临床资料和临床特征患者癌组织中PD⁃1 和NLRP3 表达比较Table 2 Comparison of PD⁃1 and NLRP3 expression in cancer tissues of patients with different clinical data and clinical characteristics

2.3 甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1 和NLRP3表达对其临床特征的影响

甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1和NLRP3的mRNA 相对表达量和蛋白阳性表达率可影响其肿瘤直径、局部侵犯、TNM 分期等临床特征（P<0.05）。见表3。

表3 甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1 和NLRP3 表达对其临床特征的影响Table 3 Effects of PD⁃1 and NLRP3 expression in cancer tissues of patients with papillary thyroid carcinoma on its clinical characteristics

3 讨论

甲状腺乳头状癌的肿瘤大小、腺外浸润状况、颈淋巴结转移、远处转移等临床特征有明显的个体差异性，且预后情况差异较大［6⁃7］。本研究的甲状腺乳头状癌患者中，有超过40%患者的肿瘤直径≥2 cm、TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期且存在局部侵犯，进一步表明甲状腺乳头状癌患者临床特征的个体差异性，而不同临床特征患者的预后差异较大，因此，明确甲状腺乳头状癌临床特征的影响因素可能通过相关干预进行疾病预防和预后的改善。

免疫炎症及其相关因子在甲状腺癌中扮演重要作用［8］。PD⁃1为免疫相关基因，主要在T 淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达，以PD⁃L1 和PD⁃L2 为配体，与PD⁃L1 结合时可将抗原递呈信号转导过程进行阻断，从而阻断机体免疫监视机制，为肿瘤的免疫逃逸提供有利条件，促进肿瘤的发展［9］。已有研究表明甲状腺癌中PD⁃1 具有较高的蛋白表达率［2，10］。本研究中，甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于其癌旁组织，进一步证实了PD⁃1 参与甲状腺乳头状癌发生发展的可能性。本研究中不同肿瘤直径、局部侵犯、TNM 分期患者的癌组织中PD⁃1 的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率比较差异明显，提示PD⁃1 表达与甲状腺乳头状癌患者临床特征可能相关，而进一步的Logistic 回归模型分析结果证实了甲状腺乳头状癌患者癌组织中PD⁃1的mRNA 相对表达量和蛋白阳性表达率可影响其肿瘤直径、局部侵犯、TNM 分期等临床特征，PD⁃1 抑制剂及时干预可能有助于改善甲状腺乳头状癌临床特征状况，间接促进预后情况的改善。

NLRP3 为最具特征性的在多种恶性肿瘤中均发挥着促癌作用的炎症小体，可通过降低细胞毒性T 淋巴细胞的活性及比例从而肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤作用从而促进肿瘤进展［11⁃12］。本研究结果显示，甲状腺乳头状癌患者癌组织NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均高于其癌旁组织，进一步证实了NLRP3 与甲状腺乳头状癌密切相关。且本研究中，不同肿瘤直径、局部侵犯、TNM 分期患者的癌组织中NLRP3的mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率均差异明显，而进一步Logistic 回归模型分析结果证实了NLRP3 表达状况亦与甲状腺乳头状癌的临床特征密切相关。

综上所述，PD⁃1 和NLRP3 在甲状腺乳头状癌组织中的mRNA 和蛋白表达水平均较高且可影响患者多种临床临床特征，两者联合干预可能辅助甲状腺乳头状癌病情乃至预后改善。