分泌型蛋白在沙眼衣原体活动性感染中的诊断价值

袁红霞 龙歆孜 陈虹亮 周安文 蔡友香 罗丽裴

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一种专性细胞内病原体，可通过感染阴道、尿道、直肠粘膜、眼结膜等部位引起人类各种疾病，如致盲性沙眼、男性前列腺炎、女性输卵管炎症和不孕症、新生儿眼结膜炎和肺炎等［1］。早在2012年WHO 预估全球每年Ct 感染率可高达1.31 亿，超过梅毒、淋病位居首位［2］。此外，未经正规治疗的Ct 活动性感染几率高达89%［3］。可见，Ct 感染已成为全球性的公共卫生问题。然而，Ct 感染后通常无明显症状，易被忽视而延误诊治，以致感染持续反复迁延，造成不可逆的病理变化及严重并发症［4］。因此，建立Ct 感染快速及准确地的诊断方法尤为重要。研究表明，Ct 感染引起的病变主要是由于其感染期间释放的宿主因子引发的炎症，而分泌型蛋白可克服宿主防御机制，以改变细胞质液泡腔内环境、修饰细胞质液泡膜、操纵宿主细胞胞质溶胶中的宿主信号通路，在活动性感染过程中产生并显着富集［5］。故本研究通过基因工程方法筛选特异性重组抗原，以分泌型蛋白为包被抗原建立间接ELISA 法检测Ct 感染血清，评价其诊断应用价值，为Ct 感染临床诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

Ct 菌株（美国菌种保藏中心）、Hela 细胞（上海中科院细胞库）、质粒提取试剂盒和PCR 纯化试剂盒（OMEGA 工业仪器中国总公司）、DNA 和蛋白分子量标准（美国EpochBiolabs 生物技术公司）、蛋白印迹法检测试剂盒（Amersham Biosciences 公司）、Ct IgG ELISA 检测试剂盒（晶美生物工程有限公司）、琼脂糖（重庆奥哲科技有限公司）、胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司）、电泳仪及水平电泳槽（美国Bio⁃Rad 公司）、恒温培养箱（上海跃进科学仪器厂）、DU640 型核酸蛋白定量分析仪和高速冷冻离心机（美国Beckman 公司）、Hema4800 型PCR 仪（珠海黑马生物科技有限公司）等。PBS、TBS、缓冲液、LB 培养基等配制均参考《分子克隆实验指南》［6］。

1.2 临床标本

收集2020年01月至2021年12月湖南省郴州市第一人民医院检验科采集的220 份疑似为Ct 感染的人血清样本，其中包括性传播性疾病87 例、泌尿生殖系统感染71 例、不孕不育症患者35 例、呼吸道感染27 例，均采用经晶美公司Ct IgG ELISA 试剂盒检测，其中，Ct检测阳性者60例，Ct检测阴性者160例。

1.3 实验方法

1.3.1 获取基因序列

通 过 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez）对沙眼衣原体已知分泌型效应蛋白进行Ct 蛋白筛选，用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行蛋白⁃蛋白间同源性对比，找到同源性最高的假定蛋白。通过检索，发现质粒糖蛋白3（plasmid glycopro⁃tein 3，Pgp3）基因（序列号：CP002055）同源性在94%～100%之间，故将其作为本次研究的目的基因。

1.3.2 PCR 扩增产物检测

根据Pgp3基因序列，对照pET30a（+）载体上的多克隆酶切位点，在引物的5′端添加合适的酶切位点，上游引入NdeⅠ，下游引入XhoⅠ，分别加上保护性碱基，获得引物序列为5′⁃GGAATTC⁃CATATGATGGG AAATTCTGGTTTTTACTT⁃3′、5′⁃CCGCTCGAGTTAACCAT TTGTTTGTTGTTT⁃TAC⁃3′。提取Ct DNA 模板进行PCR 扩增。

1.3.3Pgp3表达载体的构建及鉴定

对PCR 扩增产物进行纯化，OMEGA 质粒试剂盒进行pET30a 质粒DNA 的提取，在0.2 mLEP管中加入NdeⅠ和XhoⅠ试剂等，37℃水浴双酶切8 h，终止酶切反应后加入1 μL 溴酚蓝上样缓冲液，混匀后在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（5 v/cm），观察电泳结果并保存实验结果。在DNA 扩增仪上，按94℃5 min、94℃1 min、退火60℃1 min、延伸72℃2 min、末次循环后72℃10 min 的条件进行反应，结果同样以电泳鉴定。

1.3.4 重组蛋白Pgp3 的IPTG 诱导表达

将含有重组菌的LB 液体培养基按1∶50 的体积接种到5 mL 培养基中，培养条件为：37℃、13 000 rpm，离心半径9.54 cm，离心20 min，pET30a 空载培养方法一样。当瓶中菌液呈云雾状时，分装到小摇菌瓶中（其中温度分别为：10℃、16℃、24℃、30℃、37℃；浓度分别为：不加IPTG、加0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L 的IPTG），继续37℃，180 r/min 摇床上培养。诱导培养5 h 后，对菌液进行4℃，13 000 r/min，离心半径8.31 cm，离心10 min，弃去上清，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白电泳，观察最适重组蛋白IPTG 诱导温度及浓度。

1.3.5 重组蛋白Pgp3 的Western⁃blot 分析

将剪切好的PVDF 膜激活，并转移到转移缓冲液，使用电泳仪在125 mA 下静置1 小时。结束后的聚丙烯酰胺凝胶转至缓冲液中待用，在4℃，220 mA 稳流转膜90 min，转膜结束后，取膜到合适的容器中，加入1×PBST 摇5～10 min，弃PBST，在10 mL PBSM 中封闭，4℃下孵育过夜，并与血清在室温下轻轻搅拌孵育2 h。在PBST⁃中洗涤3 次后，将膜与辣根过氧化物标记的二抗1∶10 000 稀释，室温孵育1 h。通过化学发光成像系统（electrochemilu⁃minescence imaging，ECL）显色，观察蛋白质条带。

1.3.6 间接ELISA 法的建立及其初步评价

以棋盘滴定法确定包被浓度（1 μg/mL）和血清稀释度（1∶100），以含1 μg/mL 纯化重组蛋白的碳酸盐缓冲液包被96 孔微量反应板，4℃过夜，经5%脱脂奶粉的PBS 液封闭。以晶美公司Ct Ig G ELISA 阳性和阴性血清标本试剂盒为对照，与自建间接法平行检测220 例临床血清标本，检测结果计算敏感度、特异度、符合率。

1.4 统计学方法

实验数据使用SPSS 25.0 统计软件分析；计数资料以n描述，采用卡方检验；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pgp3 目的基因的PCR 扩增

经1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的基因Pgp3在对应的位置上（大小约564 bp）可见清晰的条带，与预期片段一致。见图1。

图1 Pgp3 基因的PCR 扩增Figure 1 The PCR amplification of the Pgp3 gene

2.2 p ET30a/Pgp3 表达载体鉴定

在对应的位置上（大小约792 bp）可见清晰的条带。见图2。经NdeⅠ和HindⅢ双酶切，得到大小约为792 bp 的清晰条带。见图3。

图2 重组质粒pET30a/Pgp3 的PCR 鉴定Figure 2 PCR characterization of the recombinant plasmid pET30a/Pgp3

图3 重组质粒pET30a/Pgp3 的双酶切鉴定Figure 3 Identification of the double enzyme digestion of the recombinant plasmid pET30a/Pgp3

2.3 重组蛋白Pgp3 的表达情况

诱导温度为10℃时条带最粗。见图4。诱导得到0.6 mmol/L 出现相应的蛋白条带最粗。见图5。

图4 pET30a/Pgp3 蛋白表达最佳诱导温度Figure 4 Optimal induction temperature of pET30a/Pgp3 protein expression

图5 pET30a/Pgp3 蛋白表达最佳诱导浓度Figure 5 Optimal inducible concentration of pET30a/Pgp3 protein expression

2.4 重组蛋白Pgp3 的Western⁃blot 分析

阴性血清中无重组蛋白的表达，阳性血清有一条反应较弱的明显条带，抗HIS 标签有一个明显的清晰条带。见图6。

图6 pET30a/Pgp3 表达Pgp3 蛋白的Western⁃blot 分析Figure 6 A Western⁃blot analysis of the pET30a/Pgp3⁃expressing Pgp3 protein

2.5 重组蛋白Pgp3 在Ct 感染诊断中的初步应用

用商品化晶美公司Ct Ig G ELISA 试剂盒及建立的间接重组蛋白Pgp3 ELISA 法检测220 份临床血清标本，结果显示：阳性标本中，重组蛋白Pgp3的敏感度为86.21%（50/58），特异度为93.83%（152/162），与Ct IgG 试剂盒符合率为91.82%［（50+152）/220］，重组蛋白Pgp3 ELISA 间接法和Ct IgG ELISA 试剂盒检测结果比较，差异无统计学意义（χ2=0.056，P=0.814）。见表1。

表1 重组蛋白Pgp3 ELISA 间接法和Ct IgG ELISA 试剂盒检测结果比较Table 1 Comparison of results by recombinant protein Pgp3 ELISA and Ct IgG ELISA kit

3 讨论

Ct 的质粒含有8 个开放阅读框，即Pgp1～8，其中PGP4、5 参与染色体基因的表达，PGP1、2、6、8 与质粒的维护和复制相关，为只有Pgp3 是唯一一个能分泌到宿主细胞质的质粒糖蛋白［7⁃9］。因此，本研究从生物信息角度筛选了Pgp3作为假定效应蛋白基因。

研究以Ct 血清标准株基因组DNA 为模板，对Pgp3基因进行PCR 扩增，同时选用含有原核表达载体pET30a 成功地构建了pET30a/Pgp3重组质粒；通过对重组质粒进行酶切鉴定分析，证实了Pgp3基因的一致性，确保了下一步研究的可靠性。p ET30a 表达载体具有HIS⁃tag 小分子标签，有利于蛋白的纯化，但不同的培养诱导浓度及培养温度对其表达效率可能存在一定影响［10］。既往研究表明，诱导培养温度低及剂量的减少可避免包涵体的形成［11］。本研究经反复摸索和优化条件，发现Pgp3重组蛋白在10℃、0.6 mmol/L IPTG 浓度下呈现良好的表达效果，同时发现该条件下Pgp3重组蛋白以包涵体形式表达，且能得到较多的可溶性蛋白。包涵体结构稳定，可用低浓度的表面变性剂、活性剂等除去其中杂质，有利于纯化包涵体［12］。本研究在确定Pgp3重组蛋白表达条件及形式后，按照常规的方法进行纯化，再经Western⁃Blot 鉴定，结果发现，在蛋白电泳胶块上大小约29 KD 处的Pgp3 目的蛋白的存在较好的特异性，证明可用于针对Ct 感染的抗原诊断方法的后续实验研究。

临床诊断研究初步证明，以Pgp3 重组蛋白建立间接ELISA 检测和Ct Ig G ELISA 试剂盒比较，重组蛋白Pgp3 的敏感度为86.21%，特异度为93.83%，Pgp3 重组蛋白建立间接ELISA 检测与Ct IgG 试剂盒符合率为91.82%。从数据上看，Pgp3重组蛋白的敏感度略高与Ct IgG 试剂盒，但二者比较并无显著性差异。但从总体研究来看，以Ct Pgp3 重组蛋白为基础建立的间接ELISA 法具有较好的敏感性和特异性，可用于Ct 活动性感染的特异性抗体检测。有研究表明，Pgp3 为外膜复合体的组成成分，具有很强的免疫原性［13］。在动物实验研究中，Pgp3 作为毒力因子，可促进巨噬细胞和树突状细胞的吞噬功能，其基因缺失或表达异常将引起小鼠体内的播散感染，如输卵管病变及胃肠道的感染，不过其致病机制目前仍不明确［14］。在临床诊断上，Wills 等［15］比较以其与其他三种以商品化Ct ELISA 检测试剂盒比较，Pgp3 蛋白的特异性和敏感性分别为95%和74%，明显高于其他三种商品化ELISA。因此也证实了Pgp3 蛋白在Ct 感染的诊断上可能有较高的诊断价值。

综上所述，本研究获得了纯化的Ct 重组蛋白Pgp3，其具有较好的免疫原性，同时，以Pgp3 蛋白建立的间接ELISA 法的具有较好的特异性和敏感度，且与商品Ct IgG ELISA 试剂盒检测结果符合率高，可能有望作为Ct 活动期感染的血清学诊断的候选抗原。