凝血因子与妊娠期高血压疾病发生的相关性

李智 郝辰珺 李艳秋

在正常生理状态下，机体凝血与抗凝血处于动态平衡，促进和抑制血液凝固的物质相互作用与制约构成了凝血过程的自我控制与调节［1］。当正常晚期妊娠时机体处于一种高凝状态，这种高凝状态有利于防止分娩时过多出血［2］。但这种高凝状态，一旦有产科诱发因素存在很容易发展成妊娠期高血压疾病［3］。而妊娠期高血压疾病又是产科常见并发症，成为产妇死亡的主要原因［4］。

随着蛋白质组学的迅速发展，血液蛋白质组学成为了研究HDCP 病因、发病机制及相关标志物的一个重要组成部分［5］。机体的凝血因子与炎性因子作为蛋白质很容易通过蛋白质组学的检测发现。

在本研究中，通过比对妊HDCP 与正常妊娠患者血清蛋白质组学分析，利用高通量蛋白质组学方法筛选出与HDCP 及凝血因子相关的蛋白质作为代表性的诊断标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

血清样本均来自广州市番禺区妇幼保健院（何贤纪念医院），在2020 至2021年间招募了妊娠期女性，所有纳入该研究的研究者均在本院围产医学门诊建卡并按期随诊，采集患者信息资料，如身高、体重、年龄、孕前体重指数BMI，孕期4～20 周的血压情况。最终在所有受试者中各选取12 例年龄、BMI、孕周（孕4～20 周）相匹配的患者作为HDCP 组与健康对照组，取每组成员的血清作为研究样本。纳入标准：HDCP 组，符合中华医学会妇产科学分会2020年公布的妊娠期高血压疾病诊治指南中HDCP 的诊断［6］：收缩压（SBP）>140 mmHg，舒张压（DBP）>90 mmHg。分为轻度（SBP 140～149 和DBP 90～99 mmHg），中度（SBP 150～159和DBP 100～109 mmHg）和重度（SBP≥160 和DBP≥110 mmHg）。满足以下四种情况之一：①先前存在的高血压；②妊娠高血压和先兆子痫（PE）；③先前存在的高血压加上叠加的妊娠高血压伴蛋白尿④无法分类的高血压［7］。经血压监测确诊，自然受孕且单胎妊娠，胎儿宫内发育正常。正常妊娠组：确诊的无妊娠期高血压疾病的孕周4～20 周的与疾病组匹配的同期孕妇。排除标准：经检查无肝、肾、心血管、出血及血栓性疾病史，既往有高血压病史、流产史、重要脏器疾病、精神异常、多胎妊娠的患者，且一个月内服用过任何影响凝血功能的药物。研究获得伦理委员会审批，所有受试者均签署书面同意书。

1.2 样本采集

HDCP 组12 例，来自妇产科住院病人；正常妊娠组12 例，来自门诊产检病人。各组人员均在早上采集空腹静脉血5 mL，放入EDTA K2管中，在4℃条件下放置30 min，以1 000 g，4℃离心5 min，取分离血清成分转移入1.5 mL 试管或离心管于-80℃冰箱冻存。

1.3 样本处理

样本进行蛋白质提取，蛋白定量，蛋白酶切后进行iTRAQ 试剂标记，后采用第一维高pH⁃RP 液相分离及第二维反相液质联用RPLC⁃MS 检测进行质谱检测，分离后的肽段直接进入质谱仪Ther⁃mo Scientific Q Exactive 进行在线检测。

1.4 统计学方法

实验使用Proteome Discoverer 2.2（Thermo fisher）软件进行数据库检索；采用SPSS 21.0 专业统计学软件进行数据分析；计量资料以（）表示，进行t检验；计数资料以率n（%）表示，用χ2检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者临床资料统计

两组受试者除血压外，其他资料数据比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of clinical data（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of clinical data（±s）

特症HDCP 组正常妊娠组t 值P 值n 12 12年龄（岁）26.37±3.03 25.28±2.83 0.911 0.372 BMI（kg/m2）26.86±3.5 25.59±3.90 0.840 0.410孕周（周）15.92±2.2 16.22±2.30 0.327 0.747收缩压（mmHg）132.21±10.98 111.56±12.12 4.374<0.001舒张压（mmHg）86.11±18.82 66.56±15.99 2.742 0.012

2.2 样本定量结果

本试验采用Bradford 定量法和SDS⁃PAGE 对样品进行质量检测，各样本，无高峰度蛋白、杂质污染和蛋白降解。

2.3 鉴定与定量结果评估

对鉴定到的多肽长度进行分析显示，本次蛋白质组检测中，大部分的多肽长度分布在6～20 个氨基酸之间。说明蛋白组检测前期样本处理符合要求。见图1。

图1 质谱检测多肽长度分布范围图Figure 1 Mass spectrometry detection of peptide length distribution range

通过对原始数据分析显示，本次试验中有68个蛋白是通过单一的多肽进行鉴定（占鉴定到的总蛋白的比例为：68/514=13.2%），超过86.8%的蛋白是通过两条以上的多肽同时进行鉴定和半定量分析，数据质量符合蛋白组检测要求。见图2。

图2 蛋白鉴定采用多肽数量分布图Figure 2 Protein identification using peptide quantity distribution map

通过对差异蛋白的分布进行分析，显示大部分蛋白分布于中心无差异区域，只有少量的蛋白分布于具有显著差异的两端（上调和下调）区域，见图3。

图3 质谱检测蛋白差异分布图Figure 3 Mass spectrometry detection protein difference distribution map

2.4 差异指标筛选

采用变异倍数分析（Fold Change Analysis，FC Analysis）、ANOVA 检验对蛋白质进行单变量统计分析，并绘制火山图（Volcano Plot）。同时筛选变化倍数（fold change）大于或小于1.2 倍以及显著性分析p value<0.05 的指标。见图4。

图4 质谱检测火山图Figure 4 Mass spectrometry detection volcano map

经过分析得到140 种差异显著的蛋白质，经筛选，140 种差异显著的蛋白质中有4 种是与抗凝凝血因子相关，分别是抗凝血酶⁃Ⅲ（antithrombin⁃Ⅲ）、凝固辅助因子Ⅸ（Coagulation factor IX）、F13A1 凝血因子A1 亚基前体（F13A1 coagulation factorA1 subunit precursor）、凝血因子Ⅹ（Coagulation fac⁃tor X）（P<0.05），FDR 为p 值的矫正系数。见图5。

图5 凝血相关的差异蛋白质谱Figure 5 Coagulation⁃related differential protein profile

3 讨论

HDCP 在我国的发病几率达到9.4%，而国外的发病几率高达7%～12%，已经严重影响了母婴健康。这种妊娠期并发症已被证实为引发不良妊娠结局的主要原因［7］。研究显示，HDCP 的女性患胎膜早破，脑血管事件，器官衰竭和弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation DIC）的风险更高［8］。目前，有报道认为人体血液凝固平衡系统紊乱而导致血液呈现高凝状态是诱发HDCP的独立危险因素［8］。而也有研究显示，血脂水平和炎性因子在的发病过程HDCP的发生、发展中扮演了重要的角色［9］。

HDCP 时全身小动脉痉挛性收缩，缺氧受损，内皮细胞肿胀、变性、缺血，而血流缓慢，血液粘度增加，血小板及纤维蛋白原可粘附基质上，使纤维蛋白原、血小板及其他凝血因子消耗。使其凝血酶原时间（PT）明显增高，纤维蛋白原消耗性降低，凝血因子Ⅵ明显消耗性下降，胎盘等分泌组织凝血活酶（TF）增多而组织因子途径抑制物（TFPI）则消耗性下降，这种凝血状态很易发生DIC，由于纤维栓子阻塞于微血管内，可引起内脏器官受损，如未能及时诊断和处理，可导致孕产妇死亡。故HDCP 发病过程与弥漫性血管内凝血的过程关系密切。DIC 的发生与多种凝血因子相关。本研究发现了与妊娠期高血压相关的4 种凝血因子：抗凝血酶⁃Ⅲ、凝固辅助因子Ⅸ、F13A1 凝血因子1亚基前体、凝血因子Ⅹ，这四种凝血因子均参与凝血途径与凝血机制并发挥作用。

肝素与ATⅢ所含的赖氨酸结合后引起ATⅢ构象改变，使ATⅢ所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝氨酸残基结合。研究表明，HDCP 的孕妇中AT 的水平显著升高，处于慢性DIC 状态，导致抗凝血酶Ⅲ的消耗增加和血浆浓度降低［10］。

凝固辅助因子Ⅸ被认为是在凝血过程中被激活之前作为惰性酶原在血液循环中。它抑制细胞迁移，增加对基质的粘附力并增强细胞间粘附力。相反，活化的凝血因子增强了细胞迁移，抑制对基质的粘附，并抑制了细胞间的粘附［11］。它作用于外源与内源途径的十字路口，并作用于血管损伤部位的血小板促凝膜，HDCP 的发生可能导致凝血因子IX 增加，加速内源性凝血进程［12］。

凝血因子Ⅲ是外源性凝血途径的起始因子，通过与凝血因子Ⅶ结合并使其激活，形成TF⁃FVⅡ/FVⅡa 复合物，同时激活凝血因子IX、X 而启动血液凝固级联反应。凝血因子X 通过内在的Xase 复合物激活，由IXA 因子结合到膜上的VIA 因子，是放大凝血反应所必需的［14］。

妊娠期血液高凝状态是一种常见现象，正常孕妇孕12 周时，Ⅱ、Ⅷ、Ⅹ因子和纤维蛋白原增高。抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S 和其他抗凝物因子的改变不平衡，蛋白S 下降40%～50%，抗凝血酶Ⅲ和蛋白C 仍保持稳定。纤溶酶原和尿激酶下降，高半胱氨酸（Hhcy）和Ⅺ因子增加。两种或以上因素互相作用，有利于血液高凝状态形成，而血液高凝状态又是HDCP 的一种常见现象［15］。现在临床主要面对的问题是，因未能及早识别妊娠期血液高凝状态导致发现时已进展为重症。因此，早期诊断尤为重要妊娠期血液高凝状态。而临床研究发现，它发生可能与凝血功能障碍有关。同时，妊娠期使用抗凝剂是一个重要的因素。妊娠与静脉血栓栓塞风险增加五倍有关，在产褥期风险上升到二十倍或更多。如果存在潜在的血栓形成倾向，则风险会进一步增加。静脉血栓栓塞的风险持续到产后将近12 周。HDCP 患者机体内血液普遍处于高凝状态，其凝血功能往往发生异常改变，所以及时检查凝血功能及凝血因子对妊娠期高血压疾病诊断起着重要作用。