正交实验法优选黑曲霉发酵柴胡黄芩药对的发酵工艺

田 健，孟凡娟，白健琳，郭远达，曲雁斌，金宇昕

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林省妇幼保健院，吉林 长春 130061)

柴胡、黄芩是历代医家广为应用的临床“药对”之一，是最具代表临床效验方。柴胡是吉林省道地药材，黄芩主产区为长白山。黄芩是多年生草本植物，具有清热抗菌、消炎[1]、抗氧化[2]等功效[3-4]。柴胡为常用的解表药，具有和解表里的功效，通常用于治疗感冒发热、肝郁气滞等症状。大量研究表明，柴胡中的有效成分可以保护肝脏[5]，具有抗氧化、抗炎[6]、抗菌以及抗肿瘤[7]等作用[8-9]。作为经典古方，柴黄药对有显著的疾病防治作用，是最具代表意义的基本配伍组成，并且在药理实验中表明，对于缓解肝损伤、抗病毒、抗肝纤维化、解热、抗病毒、治疗肝癌、抗癫痫和利胆等方面具有较好的疗效[10]。

黑曲霉是一种能产生水解酶、淀粉酶、鞣酸酶、果胶酶等的真菌，它能破坏植物细胞壁，释放营养物质。该菌种生长旺盛，发酵周期短，可以降低发酵周期，提高发酵速率。将黑曲霉与柴胡、黄芩进行生物转化，由于黑曲霉可以产生果胶酶等酶破坏植物细胞壁，所以既保持黑曲霉产酶特性，又提高了柴胡黄芩活性成分的提取率，减少药材浪费，降低生产成本。

在发酵工艺方面，本实验采用的是固体发酵。固体发酵具有发酵培养基原料来源广泛、操作简单、环境污染小等优质特点[11]。应用现代微生物发酵技术与中药资源有机结合，利用药用真菌生物转化中药中的活性成分，使得菌株的转化过程具有“双向性”，为疾病的预防和治疗以及药品研发做出巨大贡献[12]。

1 实验部分

1.1 试药与仪器

柴胡药材(批号：20201001)、黄芩药材(批号：20190601)，均购自吉林国安药业有限公司，经长春中医药大学肖井雷副教授鉴定符合《中国药典》2020年版一部项下规定。黑曲霉(编号：0A1004)、芦丁对照品(批号: 100080-201811，中国食品药品检定研究院)、纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；乙醇(北京化工厂)；其他试剂均为分析纯。

AB135-S型分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-250型超声波处理器(昆山市超声仪器有限公司)；SW-CJ-LFD型超净工作台(上海博迅实业有限公司)；DPS-9162B-2型恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；SPX-2250BF-2型摇床培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，T6型紫外分光光度(普析通用有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品的制备

精确称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇溶解后定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的对照品储备液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备

将柴胡黄芩药对发酵产物粉碎过60目筛，称取10 g发酵产物粉末至于50 mL的具塞锥形瓶中，加入60%乙醇40 mL后密封，置于超声提取器中提取1 h。将提取液以12 000 r/min高速离心10 min，取上清液，即供试品溶液，保存备用。

2 实验结果

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法进行显色反应。分别精密吸取对照品储备液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2 mL于5mL容量瓶中，分别加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL，静置6 min，并用60%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀。通过紫外-可见分光光度法于510 nm处测定吸光度值，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为Y=10.595X-0.004，R2=0.999 6，表明在 0～0.8 mg/mL 之间呈良好的线性关系。结果见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.1.2 精密度试验

用移液管精密吸取对照品溶液，依NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色后，通过紫外-可见分光光度法连续测6次吸光度值，计算得出相对标准偏差(RSD)为1.20%，表明该方法精密度良好。

2.1.3 稳定性试验

精密称取同一批柴胡黄芩发酵产物粉末，分成6份，在室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h，按照“1.2.2”配制供试品溶液的方法，依法显色，对柴胡黄芩药对发酵产物溶液进行含量测定，通过紫外-可见分光光度法测吸光度值，计算得出相对标准偏差(RSD)为1.89%，结果表明，在实验条件下此方法稳定性良好，并且在24 h内稳定。

2.1.4 重复性实验

精密称取同一批柴胡黄芩药对发酵产物粉末，分成6份，将按照前文1.2.2供试品溶液制备的方法，依法显色后，对柴胡黄芩发酵产物溶液的含量进行测定，经过紫外-可见分光光度法测吸光度值，计算得出相对标准偏差(RSD)为1.40%，从结果可看出，含量测定方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率实验

精密吸取已知含量的柴胡黄芩发酵产物6份，精密加入与样品中含量相等的芦丁对照品，按照“1.2.2”将其制备成供试品溶液，依法显色后，经过紫外-可见分光光度法测吸光度值，计算得出相对标准偏差(RSD)为1.88%，平均回收率为100.50%，从结果中可看出，该方法回收率良好。

2.2 正交实验优选发酵工艺

以发酵后柴胡黄芩药对中有效成分提取量为评价指标，采用正交实验法优选提取工艺条件。预实验影响柴胡-黄芩固体发酵主要因素为：初始含水量A；发酵温度B；液料比C，每个因素选择三个水平，采用 L9(34) 正交实验，因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

根据因素水平表，通过L9(34) 正交实验法，按照柴胡黄芩固体发酵方法培养，称取柴胡黄芩药材各25 g，加入柴胡黄芩总重量0.5%的CaCO3混合均匀，置于250 mL三角瓶中，分别加入20 mL、25 mL、30 mL的水，至高压蒸汽灭菌锅中121℃、0.1 MPa灭菌60 min。灭菌后，至无菌操作台上，将黑曲霉摇瓶种子液25 mL、50 mL、75 mL分别接种至灭菌后的三角瓶中，并将其分别放在24℃、28℃、32℃的恒温培养箱中培养。培养10天后，取出发酵好的柴胡黄芩，灭活后烘干，含量测定。结果见表2和表3。

表2 正交实验的 L9(34) 表及实验的结果

表3 发酵条件实验结果方差分析

通过表2、表3的方差分析结果可以看出，各因素对实验结果影响的顺序依次为C>B>A，即液料比是显著的影响因素，发酵温度是次要影响因素，初始含水量对实验结果影响较小。从各因素水平(K值分析) 并结合生产实际情况及实验操作，综合以上分析结果，可以确定最佳的发酵条件为A1B2C2，即加入柴胡黄芩总重量0.5%的CaCO3混合均匀，置于250 mL三角瓶中，加入柴胡黄芩总重量40%的水。至高压蒸汽灭菌锅中121℃、0.1 MPa、60 min进行灭菌。灭菌后，至无菌操作台上，柴胡黄芩总重量与黑曲霉摇瓶种子液按1∶1加入三角瓶中发酵，发酵温度为28℃。

2.3 最佳工艺验证实验

取柴胡黄芩各25 g，按本实验得出的最佳工艺方法：加入柴胡黄芩总重量0.5%的CaCO3混合均匀，置于250 mL三角瓶中，加入柴胡黄芩总重量40%的水。至高压蒸汽灭菌锅中121℃、0.1 MPa、60 min进行灭菌。灭菌后，至无菌操作台上，柴胡黄芩总重量与黑曲霉摇瓶种子液按1∶1加入三角瓶中发酵，发酵温度为28℃。进行重复实验三次，测定样品的总黄酮含量。结果说明三次实验结果的综合评分最高。相对标准偏差(RSD)为1.26%，说明最佳发酵工艺条件稳定可靠。

3 结果与讨论

本实验采用不同波长对黑曲霉发酵柴胡黄芩药对中总黄酮的含量进行测定，参考《中华人民共和国药典》2020 年版和相关文献报道[13-17]，同时考察了供试品溶液在271 nm、278 nm、415 nm、510 nm 处的待测成分吸收情况,结果发现在510 nm处总黄酮具有良好的吸收。

通过正交实验，对液料比、发酵温度、含水量3个因素进行考察，以总黄酮作为指标综合评价，确定了发酵柴胡黄芩药对的最佳工艺。黑曲霉发酵柴胡黄芩药对，可使药对中有效成分明显提高，既可增加柴胡黄芩药对的利用率，又使柴黄药对中的一些活性成分进行了生物转化，有利于柴胡黄芩药对的活性研究。此次实验首次将黑曲霉运用在柴胡黄芩药对的生物转化中，为药对的发酵以及黑曲霉的发酵提供了新的想法，为后续开展柴胡黄芩药对的生物转化奠定了基础，并促进了中药资源的可持续发展。