4种不同海藻提取物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖活性的影响

邱小明

(1.漳州职业技术学院食品工程学院，福建 漳州 363000;2.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心，福建 漳州 363000)

海藻(Algae)是海洋中的生产者，主要包括绿藻、红藻、蓝藻和褐藻四大类[1]。随着人们对海藻的不断认识，人类对海藻的利用也由简单的食用到开发新型药物。现今，随着现代生化分离纯化技术的发展和各种药物筛选方法的发现，人们对海藻的利用取得了更大的成果，从中找到了许多具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗心血管疾病的重要生物活性物，主要有：多糖类、多酚类、甾醇类、黄酮类、萜类、大环内酯类、环状多硫化合物等[2-3]。天然药物在肿瘤的临床治疗上有副作用小、抗癌谱广等优点，这些优点使得海洋药物研发具有广阔的前景[4]。海藻资源是抗癌活性物质研究的重要来源之一，利用藻类来开发研究新的抗肿瘤物质一直是研究的热点，据美国NCL报告，3.5%的海藻提取物具有抗肿瘤活性或细胞毒性[5]。近年来从藻类中发现许多的酮类、甾体、萜类及含氮化合物等结构新颖的物质，它们都具有显著的抗肿瘤活性[6]。从海藻中提取的二十二碳六烯酸(DHA)可以抑制前列腺癌、结肠癌和乳腺癌细胞的生长，研究表明增加DHA的摄取量能预防癌症的发生[7-8]。近年来，已上市的海洋抗肿瘤药物有阿糖苷、曲贝替定和甲磺酸艾日布林等，许多海藻提取物正在实验和临床研究中，此外，还有许多的海藻资源待研究开发。

本研究以福建省四种主要经济海藻(浒苔、紫菜、江蓠和海带)为原料，采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇三种不同溶剂进行提取，得到12种粗提物组分，利用MTT法进行抗肿瘤活性检测评价各组分抑制肿瘤细胞增殖活性，探讨四种海藻提取物与抑制肿瘤细胞活性之间的关系。

1 材料与设备

1.1 实验原料

紫菜、江蓠、浒苔、海带购自福建漳浦，四种海藻粉碎过60目筛。

1.2 实验仪器

FDU-1200真空冷冻干燥箱，SHB-III循环水式真空泵，实验室超纯水器，HH-4数显恒温水浴锅，HQ2200型超声波清洗器，YRE-202A真空旋转蒸发器，-80℃ULT低温冰箱，电子天平BA124S、2202S 型，高速离心机RX15，2.5-1000 μL移液枪，UV-1800紫外可见分光光度计，96孔板，CO2培养箱，倒置光学显微镜，超净工作台，DZF-6020型真空干燥箱，立式压力蒸汽灭菌器，超低温离心机，细胞培养瓶，SH-1000酶标仪，pH计。

1.3 主要试剂

六水合三氯化铁，甲醇，乙酸乙酯，乙醇，香草醛，葡萄糖，石油醚，福林试剂，硫酸亚铁，冰醋酸，丙酮，胆固醇，芦丁，熊果酸，没食子酸，硫酸，磷酸，二甲基亚砜，盐酸，无水三氯化铝，苯酚，磷酸盐缓冲液，两性酶素，MTT，胰蛋白酶。

1.4 试剂配制

(1)磷酸盐缓冲溶液(PBS)：分别称取KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，用超纯水溶解搅拌并定容至1 L，121℃高压蒸汽灭菌20 min，室温保存。

(2)培养基：取灭菌后的带刻度的玻璃瓶，倒入RPMI-1640培养基，然后加入10%的胎牛血清，0.1%的两性酶素，1%的青霉素和链霉素，摇匀存放冰箱待用。

(3)MTT溶液：避光称取MTT粉末25 mg于10 mL离心管中，加入5 mL无菌PBS溶解，即配制成质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存，一星期内用完，使用时用无酚红无血清的培养基稀释到0.5 mg/mL。

2 实验方法

2.1 海藻活性物质的提取

分别称取100 g样品，每种样品分别用石油醚、乙酸乙酯、75%乙醇提取四次，提取条件：料液比(W/V)1∶10，水浴50℃，搅拌机搅拌1 h。合并同一种海藻同一种溶剂的提取液，减压浓缩除去溶剂至少量体积。再转移至已知重量的小培养皿中，减压真空-40℃干燥或者冷冻干燥至恒重，称量，从而得到12种海藻粗提物，做好标记，置于-20℃冰箱保存。12种海藻粗提物分别为紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、紫菜75%乙醇提取物、江蓠石油醚提取物、江蓠乙酸乙酯提取物、江蓠75%乙醇提取物、海带石油醚提取物、海带乙酸乙酯提取物、海带75%乙醇提取物、浒苔石油醚提取物、浒苔乙酸乙酯提取物、浒苔75%乙醇提取物。将12种海藻粗提物放入-80℃冰箱冷冻后，取出12种海藻粗提物冷冻干燥24 h后，确保海藻粗提物足够干燥。将干燥后培养皿的总质量扣除干燥前培养皿的质量计算得出粗提物的质量，并计算出提取率。

其中，η表示提取率，α表示所得到提取物质量，β表示原料质量。

2.2 细胞的培养

(1)细胞复苏：从液氮盒中取出所需细胞冻存管，迅速置于37℃水浴解冻，并不断摇动使管内液体尽快溶解。用酒精棉球擦拭冻存管外壁，在超净工作台内将冻存液转移至1.5 mL离心管中，2 000 r/min离心 5 min,小心吸弃上清液，向离心管内加1 mL的培养基吹打成细胞悬液。取新的细胞培养瓶，加入4 mL的培养基，然后用移液枪吸取细胞悬液，加入到细胞培养瓶，并标注。摇匀，放入37℃，5% CO2条件下培养，在培养箱中适当拧松一点瓶口后，观察细胞生长状态并及时换液[9-10]。

(2)细胞保种：当细胞覆盖培养瓶底80%～90%面积时即可保种。用PBS洗涤2次，加入含1.5 mL胰蛋白酶消化，观察细胞形态，当细胞分散变圆时，吸弃胰酶，加1.5 mL培养基终止消化。用滴管将细胞吹打均匀，取2 mL离心管，2 000 r/min离心5 min,小心吸弃上清液，向两离心管内加1 mL的培养基吹打成细胞悬液。分装至冻存管(每管1 mL)，再加入DMSO 0.1 mL，-80℃保存过夜，最后放于液氮罐中长期保存，做好记录。

(3)换液：吸弃旧培养基，用PBS洗涤2次，加入5 mL新鲜培养基。

(4)传代：一般当细胞覆盖培养瓶底80%～90%面积时即可传代，吸弃旧培养基，加2 mL PBS轻荡洗涤2次。加入1 mL 含0.05% EDTA-2Na的0.25%胰蛋白酶，于倒置显微镜下观察，当细胞变圆间隙变大，细胞之间不再连接成片时即可吸弃胰酶，加入新鲜培养基终止消化，轻轻吹打至形成单细胞悬液，将细胞液分装到2～3个细胞瓶中，补加培养基至5 mL，摇匀，放培养箱37℃，5% CO2条件下常规培养。

2.3 海藻提取物抑制肿瘤细胞增殖活性评价

2.3.1 海藻提取物母液的制备

取提取的12种海藻粗提物分别称取0.01 g,加入0.1 mL DMSO中配成质量浓度为100 mg/mL的药物母液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，保存在冰箱中备用。

2.3.2 MTT法检测海藻提取物对MCF-7细胞的生长抑制作用

(1)取生长状态良好的处对数生长期的各种细胞，接种于96孔板中，每孔100 μL，5 000～10 000个细胞，培养12 h。

(2)用含10%胎牛血清的培养基药物母液分别稀释成1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL 5个质量浓度。

(3)吸弃旧培养基，加入100 μL不同浓度梯度的含药培养基作为实验组，同时设不含药物的空白对照组、不含药物与细胞的调零孔。每实验组设5个复孔，37℃，5% CO2条件下培养48 h。

(4)吸弃药液，PBS轻洗，吸弃，每孔加入100 μL MTT溶液(溶于无血清无酚红培养基中，终浓度0.5 mg/mL)，37℃反应4 h。

(5)吸弃含MTT的培养基，加入150 μL DMSO，室温轻微震荡10 min，置酶标仪于570 nm测吸光度OD值。

3 结果与讨论

3.1 海藻提取物得率

用3种不同的溶剂分别对4种海藻粉各100 g进行提取，共得到12种海藻提取物，得率详见表1。

表1 海藻提取物的质量和得率

由表1四种海藻得率分析可见，3种溶剂提取物得率依次为海带、江蓠、浒苔和紫菜。从3种溶剂分析可见，75%乙醇提取物得率是最多的，均在10%以上，其次是石油醚提取物，在1%～2%之间，而乙酸乙酯提取物最少，均低于1%。

3.2 海藻提取物抑制肿瘤细胞增殖活性评价

供实验用的细胞株为人乳腺癌细胞MCF-7，每孔细胞为4 000到10 000个，利用前文2.3.2的方法，即MTT比色法，测出其吸光值，计算得到其对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制率。按12种海藻粗提物，5个浓度梯度进行试验，结果如表2。

表2 海藻提取物对肿瘤细胞MCF-7的生长抑制率

由表2，12种海藻提取物对人乳腺癌细胞MCF-7均有一定的抑制作用，其中紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蓠石油醚提取物、海带石油醚提取物、浒苔石油醚提取物、浒苔乙酸乙酯提取物在浓度为1 000 μg/mL时，生长抑制率达80%以上。而江蓠乙酸乙酯提取物生长抑制率最高时的浓度为500 μg/mL，从四种海藻的不同溶剂的提取物来看，四种海藻的石油醚提取和乙酸乙酯提取物均有较好地抑制肿瘤细胞生长的作用，而75%乙醇的提取物中，除浒苔75%乙醇提取物外，其余提取物的最高生长抑制率均在40%以下。从12种提取物来看，提取物的浓度升高与生长抑制率升高呈线性，对于抑制人乳腺癌细胞MCF-7效果较好的是紫菜石油醚提取物和浒苔石油醚提取物。

4 结论

采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇分别从四种海藻中提取得到12种粗提物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖均有一定的抑制作用，紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蓠石油醚提取物、海带石油醚提取物、浒苔石油醚提取物效果较明显，其最高的生长抑制率均在80%以上，紫菜75%乙醇提取物、江蓠75%乙醇提取物和海带75%乙醇提取物的效果最差，均在40%以下。从四种海藻提取物分析可知，抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖效果由高至低依次是浒苔、紫菜、海带和江蓠，这四种海藻粗提物浓度为1 000 μg/mL时，三种溶剂提取物的平均生长抑制率为：86.684%、72.904%、61.078 %和 58.323%。从三种不同的溶剂分析可见，其提取物抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用效果依次为石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和75%乙醇提取物。

海洋独特的环境使得海洋生物具有一些自身特别的物质，从分析可知四种海藻提取物抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖效果依次为浒苔、紫菜、海带和江蓠。后续有望从以上四种海藻中找到作用效果好、副作用小的天然海洋抗癌药物。