乙型肝炎病毒耐药突变位点与基因型及肝硬化相关性研究

郑璟 彭燕燕

目前核苷(酸)类似物(NA)是治疗慢性乙型肝炎主要药物，强效低耐药药物如恩替卡韦(ETV)、替诺福韦酯(TDF)、丙酚替诺福韦(TAF)等已经作为临床初治患者的首选。NA在临床应用中严重不良反应较为少见，但HBV可在抗病毒药物压力下获得适应性变异，诱导HBV聚合酶基因反转录酶(RT)区域的耐药突变，使抗病毒药物敏感性下降，导致治疗失败[1]。研究表明耐药突变位点与基因型可能存在一定关联[2,3]，但尚无明确定论。本研究通过检测RT区域的耐药突变位点，分析其与不同HBV基因型、疾病进程(慢性乙型肝炎与肝硬化)的相关性，为临床病情分析及抗病毒药物的选择提供理论依据。

资料与方法

一、一般资料

2015年10月至2019年10月汕头市中心医院门诊及住院乙型肝炎患者391例，男290例，女101例。其中慢性乙型肝炎患者342例，肝硬化患者43例，肝衰竭患者4例和肝癌患者2例。诊断符合2015版《慢性乙型肝炎防治指南》，排除甲、丙、丁、戊、庚等其他类型肝炎病毒感染、药物性肝炎、酒精性肝炎及自身免疫性肝炎等可导致肝脏病变的疾病。入组患者均经过NA治疗。本研究通过汕头市中心医院医学伦理委员会批准。

二、研究方法

(一) HBV基因型及耐药突变位点检测 清晨抽取患者静脉血，4 000 r/min离心5 min分离血浆，置4℃冰箱保存。外送至广州达安临检中心检测，采用HBV耐药基因突变检测试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)进行核酸提取、扩增，最后在深圳亚能YN-H16分子杂交仪上进行杂交显色。

(二)HBV基因型及耐药位点结果判读 按照试剂盒说明书进行基因型及耐药位点显色结果分析，包括常见基因型B、C、D型及6种NAs常见耐药突变位点(野生型：rt180L、rt204M、rt207M、rt207V、rt181A、rt236N；突变型：rt180 M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T)。

三、统计学处理

使用SPSS V19.0统计软件对数据进行分析处理。不同基因型组之间、慢性乙型肝炎与肝硬化组之间不同耐药位点突变率的比较采用卡方检验进行分析，若1≤理论频数<5时，采用连续校正卡方检验；当理论频数<1时，用Fisher确切概率法计算概率。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基因型与耐药突变位点的关系

391例乙型肝炎患者中B基因型345例，其中103例有耐药位点突变，C基因型46例，13例有耐药位点突变；D基因型为0例。在HBV常见6个耐药位点中C基因型的rtL180M耐药突变率高于B基因型，且差异有统计学意义(P<0.05)，而两种基因型的其他耐药位点突变率差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。进一步分析116例联合突变模式的构成比，rtL180M+rtM204V在基因型C中的比例(6/13)显著高于基因型B(16.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 HBV常见六个耐药位点突变率与不同基因型的关系[例(%)]

表2 B和C基因型中联合突变模式构成比[例(%)]

二、HBV常见6个耐药位点突变率与慢性乙型肝炎、肝硬化的关系

选取慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者进行统计分析，位点rtA181V在肝硬化患者中的突变率(7.0%)显著高于慢性乙型肝炎患者(0.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)，其他突变位点rtL180M、rtM204V、rtM204I、rtV207I、rtN236T在突变型与野生型之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 HBV常见6个耐药位点突变率与慢性乙型肝炎、肝硬化关系[例(%)]

讨 论

由于HBV复制极其活跃并缺乏反转录酶校对功能，具有高变异性，在药物选择下产生的耐药突变容易导致病情反复，造成临床治疗困难。HBV RT区基因位点的突变与基因型、不同病程的关系错综复杂[4]。

本研究结果表明，基因型C型HBV的位点rtL180M和rtM204V+rtL180M的突变率高于基因型B型，与以往研究相一致。 Zhang等[5]报道，相比基因型B型，基因型C型中rtL180M具有更高的突变率(54.7%比36.1%,P=0.002)。Ma等[2]报道，rtL180M和rtM204V+rtL180M突变在基因型C型中更为常见。研究表明，HBV RT区核苷酸类似物耐药相关位点突变对HBV基因型具有偏向性。HBV基因组由不完全环状双链DNA构成，包括P区、S区、C区与X区四个开放阅读框，P区主要包括反转录酶(RT)、末端蛋白、非编码间隔区及RNA酶H区。由于RT区和S基因具有相同的DNA序列，RT区的变异也可以引起S基因的改变。有研究显示，rt180的沉默突变导致了S基因的错义突变，即RT区中rt180位点的突变会导致HBsAg中172 Trp>Ser (W172S)的突变[6]。而S突变可能通过不同的途径引起肝脏疾病，导致包膜蛋白和病毒颗粒的积聚和诱导内质网应激，从而促进HBV免疫逃逸和原发性肝癌的发展。本研究中rtM204V+rtL180M互补突变组合在基因型C型中的比例显著高于B 型。有报道显示rtL180M能作为补偿性突变与rtM204V共同作用而增强病毒的复制能力，增加机体罹患肝细胞癌的风险[7,8]。因此，相对于基因型B型，对基因型C型患者的突变位点检测及病情进程监测可能更显重要。

目前国内外报道了较多的rtA181V/T与肝细胞癌关系研究[9,10]，而对rt181位点与肝硬化关系研究较少。有文献报道，rt181位点突变的出现不仅增加了慢性乙型肝炎转变成为肝细胞癌的风险，而且肝硬化是这一突变发生的独立预测因子[11]。本研究发现，rtA181V在使用过NA治疗肝硬化患者中的突变率显著高于慢性乙型肝炎患者，提示rtA181V的出现与肝硬化风险的增加密切相关。rtA181T突变和rtA181V突变的变异存在不同之处：rtA181T突变导致S区sW172*取代，提前产生终止密码子，具有HBsAg和病毒粒子分泌缺陷可能导致内质网应激，最终导致肝脏疾病[12-15]；而rtA181V变异后可引起表面抗原出现氨基酸的置换，S基因173位亮氨酸被置换变异为苯丙氨酸，并不引起表面抗原的截短或缺失[16]，该位点对于肝硬化发生机制的影响还需要进一步验证。抗病毒治疗后发生肝硬化的患者肝细胞癌发生率更高，因此，及时监测慢性乙型肝炎经治患者中rtA181V突变，对于调整临床治疗策略降低病情恶化概率具有一定临床意义。

综上所述，HBV基因不同位点的耐药突变率与不同基因型和肝硬化相关。在病情早期检测不同耐药突变位点和基因型，能为临床病情监测及选择合适药物提供参考，有助于减少因耐药而导致治疗效果不佳的情况，最终使患者受益。