右美托咪定调控circ_0072995对直肠癌细胞SW480增殖凋亡的研究

王冰，吕艳玲

宝鸡市人民医院麻醉科，陕西 宝鸡 721000

直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，手术仍是其最主要治疗方式，随着新辅助放化疗、靶向治疗、免疫治疗等综合治疗手段的发展，直肠癌患者的术后生活质量和预后得到改善[1-2]。研究表明，麻醉药也是影响肿瘤患者预后的因素之一[3]。盐酸右美托咪定为肾上腺素受体激动剂，常用于麻醉时辅助镇静。有研究报道右美托咪定可改善机体免疫功能，减轻直肠癌患者行腹腔镜手术时围术期应激反应[4]。右美托咪定可显著降低腹腔镜直肠癌根治术患者的血清炎性因子水平，提高患者的肺功能，促进临床疗效[5]。此外，右美托咪定还有抗肿瘤作用，如右美托咪定通过miR-760/HDGF 信号通路减弱胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力，促进细胞凋亡[6]。右美托咪定还可通过上调miR-196a-5p表达促进结直肠癌LOVO细胞侵袭和迁移[7]。然而右美托咪定对直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及机制尚不清楚。

有研究表明circRNA与肿瘤的发生发展以及预后密切相关，在肿瘤早筛查肿瘤治疗等领域具有巨大潜力[8]，circ_0072995 在乳腺癌组织和细胞系中上调，沉默_0072995可抑制乳腺癌肿瘤生长[9]，circ_0072995通过调节miR-147a/CDK6 轴促进上皮性卵巢癌的进展[10]。然而circ_0072995 对直肠癌的影响以及右美托咪定对其影响尚不清楚。因此，本研究主要探讨右美托咪定是否可通过调节circ_0072995表达而影响直肠癌细胞生物学行为。

1 材料与方法

1.1 临床材料 选取宝鸡市人民医院2017 年1月至2021年1月收治的88例直肠癌患者的癌组织及癌旁组织标本，手术前未进行放化疗，所有患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂 SW480 细胞(美国ATCC)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；Trizol试剂、荧光定量PCR 试剂盒(大连宝生物)；右美托咪定(深圳海思安生物技术有限公司)；MTT 试剂盒、凋亡检测试剂盒(北京索莱宝)。si-circ_0072995、si-NC、pcDNA-circ_0072995和pcDNA载体质粒(广州锐博生物公司)。

1.3 细胞处理与分组 将1 mg 右美托咪定用210 mL 的0.9%氯化钠溶液稀释至浓度为10 μmol/L，然后再将10 μmol/L的右美托咪定分别用培养液稀释成浓度为1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L，然后处理SW480细胞，记为Dex 1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 组，常规培养于RPMI-1640 培养基中的SW480 细胞记为con组；将circ_0072995 干扰表达载体及阴性对照转染至SW480 细胞，记为 si-circ_0072995 组、si-NC 组；将circ_0072995过表达载体及阴性对照转染至SW480细胞后用5 μmol/L 右美托咪定处理，记为Dex+pcDNA-circ_0072995 组 、Dex+pcDNA 组 。 其 中 si-circ_0072995 序列为：5'-ACCTCAATCGCCGGG-3'，si-NC序列为：5'-TGGAGTTAGCGGCCC-3'。

1.4 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测circ_0072995 的表达水平 提取组织及各组细胞的总RNA，合成cDNA 后进行PCR，相对表达量用2-ccCt法计算。以GAPDH为内参，circ_0072995上游引物序列：5'-CAGGCCAGAGGAAAGAACAG-3'，下游引物序列：5'-CAGCGCCCCATCTCATAGCCA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGCTGAGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.5 MTT 检测细胞增殖抑制率 将各组细胞以5×103个/孔的密度细胞接种到96孔板，培养24 h后通过MTT测定评估细胞增殖抑制率。

1.6 克隆形成实验检测克隆形成数 将各组细胞以每孔100 个细胞接种于6 孔板中，培养2 周，甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h 后用预冷的 PBS 漂洗 2 次，与 500 μL 的结合缓冲液混匀；加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件进行数据统计学分析。计量资料均符合正态分布，以均数±标准差()表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0072995在直肠癌患者中的表达及其与临床病理关系 肠癌组织中circ_0072995表达水平为2.36±0.15，明显高于癌旁组织的1.00±0.02，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1；circ_0072995表达水平与患者年龄无关，与TNM 分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

图1 直肠癌组织中circ_0072995表达水平

表1 circ_0072995的表达与临床病理关系(例)

2.2 右美托咪定对SW480 细胞增殖和凋亡的影响 与con 组比较，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L组SW480 细胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成数减少，呈浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、图3和表2。

表2 右美托咪定对SW480细胞增殖、凋亡的影响(，n=9)

表2 右美托咪定对SW480细胞增殖、凋亡的影响(，n=9)

注：与con 组比较，aP<0.05；与Dex 1 μmol/L 组比较，bP<0.05；与 Dex 2 μmol/L 组比较，cP<0.05。

组别Con组Dex 1 μmol/L组Dex 2 μmol/L组Dex 5 μmol/L组F值P值抑制率(%)0.00±0.00 16.73±1.38a 29.96±2.62ab 46.14±3.71abc 613.278<0.05凋亡率(%)7.84±0.50 14.95±0.75a 19.38±1.19ab 22.16±3.78abc 85.026<0.05克隆形成数(个)119.56±7.32 93.56±4.19a 73.00±3.94ab 51.33±2.87abc 321.653<0.05

图2 右美托咪定对SW480细胞凋亡的影响

图3 右美托咪定对SW480细胞克隆形成的影响

2.3 右美托咪定对SW480 细胞中circ_0072995表达的影响 与con 组比较，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 组 SW480 细胞中 circ_0072995 表达水平降低，呈浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 右美托咪定对SW480 细胞中circ_0072995 表达水平的影响(，n=9)

表3 右美托咪定对SW480 细胞中circ_0072995 表达水平的影响(，n=9)

注：与 con 组比较，aP<0.05；与 Dex 1 μmol/L 组比较，bP<0.05；与 Dex 2 μmol/L 组比较，cP<0.05。

组别Con组Dex 1 μmol/L组Dex 2 μmol/L组Dex 5 μmol/L组F值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.47±0.03ab 0.23±0.02abc 1 024.615<0.05

2.4 沉默circ_0072995 对SW480 细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC 组比较，si-circ_0072995 组circ_0072995 表达水平降低，细胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成数减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4、图5和表4。

图4 沉默circ_0072995对SW480细胞凋亡的影响

图5 沉默circ_0072995对SW480细胞克隆形成的影响

表4 沉默circ_0072995 对SW480 细胞中circ_0072995 表达、增殖和凋亡的影响(，n=9)

表4 沉默circ_0072995 对SW480 细胞中circ_0072995 表达、增殖和凋亡的影响(，n=9)

组s别i-NC组si-circ_0072995组t值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.28±0.03 72.000<0.05抑制率(%)0.00±0.00 36.76±2.02 54.594<0.05凋亡率(%)7.91±0.61 20.41±1.21 27.674<0.05克隆形成数(个)117.00±8.41 63.78±2.39 18.261<0.05

2.5 circ_0072995 对右美托咪定处理的SW480细胞增殖和凋亡的影响 与Dex+pcDNA 组比较，Dex+pcDNA-circ_0072995 组 circ_0072995 表 达 水 平升高，细胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成数增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6、图7 和表5。

图6 circ_0072995对右美托咪定处理的SW480细胞凋亡的影响

图7 circ_0072995对右美托咪定处理的SW480细胞克隆形成的影响

表5 circ_0072995减弱右美托咪定对SW480细胞circ_0072995表达、增殖、凋亡的作用(，n=9)

表5 circ_0072995减弱右美托咪定对SW480细胞circ_0072995表达、增殖、凋亡的作用(，n=9)

组别Dex+pcDNA组Dex+pcDNA-circ_0072995组t值P值circ_0072995 1.00±0.00 3.57±0.15 51.400<0.05抑制率(%)46.23±3.27 13.75±0.81 28.033<0.05凋亡率(%)22.07±1.35 10.13±0.81 22.752<0.05克隆形成数(个)49.89±3.14 104.22±5.12 27.137<0.05

3 讨论

近年来研究发现，麻醉药能影响患者免疫系统功能和肿瘤细胞的活性，从而影响肿瘤的进展[11-12]。研究报道右美托咪定通过miR-143-3p/EPS8 轴抑制食管癌的进展[13]。右美托咪定可以通过上调miR-185表达和灭活SOX9/Wnt/β-catenin 信号通路来抑制卵巢癌的发展[14]。右美托咪定通过下调miR-1307 表达抑制骨肉瘤细胞生物学行为[15]。以上研究均表明临床常用麻醉药右美托咪定可参与调控多种肿瘤的发生发展过程。为研究右美托咪定对直肠癌的影响，本实验用不同浓度右美托咪定处理SW480 细胞，结果显示，SW480细胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成数减少，呈浓度依赖性；表明右美托咪定可抑制SW480 细胞增殖，促进细胞凋亡，提示右美托咪定在直肠癌中可能也起抑癌作用。

研究报道circ_0072995 通过miR-30c-2-3p 促进乳腺癌细胞迁移和侵袭[16]。circ_0072995 通过调节miR-122-5p/SLC1A5 轴促进卵巢癌进展[17]。敲低circ_0072995 可通过调控miR-1253/EIF4A3 信号抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭[18]。本实验结果显示，肠癌组织中circ_0072995 表达水平升高，且circ_0072995表达水平与TNM 分期及淋巴结转移相关，提示circ_0072995 可能在直肠癌中起促癌基因作用，且影响患者的病理分期及转移。进一步沉默circ_0072995 后，SW480细胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成数减少；表明沉默circ_0072995 可抑制SW480 细胞增殖，促进细胞凋亡。为研究直肠癌中右美托咪定与circ_0072995 的关系，本实验检测了右美托咪定处理后SW480 细胞中circ_0072995 的表达水平，结果显示，circ_0072995 的表达水平降低，表明右美托咪定可抑制circ_0072995 的表达；而circ_0072995过表达的同时用右美托咪定处理，结果发现，细胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成数增加，表明circ_0072995过表达可减弱右美托咪定对SW480细胞增殖和凋亡的影响。

综上所述，右美托咪定可能通过下调circ_0072995抑制直肠癌细胞增殖，促进细胞凋亡。