普鲁卡因通过调控TLR4/NF-κB通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

刘思远，于明帅，张 科

常见的心血管疾病有冠心病、高血压、动脉粥样硬化和心脏病等，具有高发病率和高死亡率的特点，心肌缺血再灌注引起的心肌损伤是心血管疾病的主要诱因，因此，如何有效减缓心肌细胞缺血再灌注引起的细胞损伤是当前医学研究的热点[1-2]。心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应作为心肌细胞缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌损伤机制[3]。普鲁卡因(procaine，PCA)是一种局部麻醉的氨基酯类药物，具有毒性小、麻醉效果好和价格便宜等优点[4]。有研究显示，PCA可以通过上调热休克蛋白27(HSP27)促进过氧化氢诱导的心肌细胞增殖，抑制心肌细胞凋亡，减缓心肌细胞的氧化损伤[5]。有研究结果显示，Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号可能参与心肌细胞H/R诱导的细胞凋亡、氧化应激和炎症反应[6]。蔡智慧等[7]研究结果显示，栀子苷可以通过抑制TLR4/NF-κB通路减缓H/R诱导的大鼠心肌细胞炎性损伤。因此，本研究通过H/R诱导心肌细胞建立模型，探讨PCA是否可以通过TLR4/NF-κB通路影响H/R诱导的心肌细胞活力、凋亡、氧化应激和炎症反应。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 大鼠H9c2心肌细胞，购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、高糖DEME培养基，购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；盐酸普鲁卡因注射液，购自江苏悦兴药业有限公司，规格：50 mg(20 mL)，批准文号：国药准字H32024570；NF-κB通路抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)，购自美国Sigma-Aldrich公司；Bcl-2抗体、Bax抗体、TLR4抗体、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65抗体、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗体、NF-κB p65抗体、NF-κB抑制蛋白(IκBα)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，购自美国Santa Cruz公司；凋亡试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 培养细胞和分组 取出H9c2心肌细胞在含有胎牛血清、双抗(1%青霉素-链霉素)的高糖DEME培养基内进行培养，且培养箱条件设置为37 ℃、5% CO2、95%N2。每隔2 d换一次培养基，待细胞生长至85%后进行传代培养。

取对数生长期的H9c2心肌细胞，然后将细胞分组，对照组(Con组)在培养箱内正常培养细胞；H/R组在95% N2和5% CO2的培养箱内培养4 h，然后在正常条件下培养6 h；PCA低剂量组(H/R+PCA-L组)、PCA中剂量组(H/R+PCA-M组)、PCA高剂量组(H/R+PCA-H组)分别采用浓度为3.50 mg/L、7.00 mg/L、14.00 mg/L的PCA处理细胞，30 min后参照H/R组培养条件，进行H/R处理细胞。H/R+PCA组、H/R+PCA+PDTC组分别采用14.00 mg/L PCA及5 μmol/L NF-κB通路抑制剂PDTC处理细胞，之后进行H/R处理。

1.3 MTT检测细胞活力 取对数生长期的H9c2心肌细胞，胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，调整细胞密度，取100 μL添加至96孔板内，每孔加入相应的MTT试剂20 μL，培养箱内孵育4 h，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)试剂。然后采用酶标仪在490 nm处检测各组细胞的吸光度值，计算细胞活力。

1.4 流式细胞术实验检测细胞凋亡 取对数生长期的H9c2心肌细胞，调整密度后添加至6孔板内，每孔内2×105个细胞，置入培养箱内孵育24 h。加入胰酶消化重悬细胞，离心倒去上清液。每孔加入相应的5 μL磷酯酰丝氨酸荧光素(AnnexinV-FITC)和10 μL碘化丙啶(PI)试剂，室温下反应20～30 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测Bcl-2、Bax和TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达 取对数生长期的H9c2心肌细胞用于提取各组细胞的总蛋白，经过BCA试剂检测定量蛋白的浓度。在蛋白加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，煮沸变性10 min后，经过SDD-聚丙烯酰胺(PAGE)分离处理，转膜，封闭，加入稀释的Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα、NF-κB p65、IκBα一抗，孵育过夜，加入二抗，孵育1 h后，加入增强电化学发光法(ECL)显影。以GAPDH为内参，通过Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α表达 取对数生长期的H9c2心肌细胞，2 500 r/min离心10 min后，收集各组细胞的上清液，然后采用LDH试剂盒、MDA试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒和TNF-α试剂盒检测LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，严格按照说明书步骤进行。

2 结 果

2.1 PCA对H/R诱导的心肌细胞活力和凋亡的影响 与Con组比较，H/R组细胞活力、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax蛋白表达明显增加(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+PCA-L组、H/R+PCA-M组、H/R+PCA-H组细胞活力、Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见图1和表1。

图1 PCA对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响(A为流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；B为各组凋亡相关蛋白表达条带图)

表1 各组心肌细胞活力、细胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达比较

2.2 PCA对H/R诱导的心肌细胞氧化应激的影响 与Con组比较，H/R组LDH、MDA明显增加(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+PCA-L组、H/R+PCA-M组、H/R+PCA-H组LDH、MDA明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组LDH、MDA水平比较

2.3 PCA对H/R诱导的心肌细胞炎症反应的影响 与Con组比较，H/R组IL-1β、IL-6、TNF-α明显增加(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+PCA-L组、H/R+PCA-M组、H/R+PCA-H组IL-1β、IL-6、TNF-α明显降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 单位：pg/mL

2.4 PCA对H/R诱导的心肌细胞TLR4/NF-κB通路的影响 与Con组比较，H/R组TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达明显增加(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+PCA-L组、H/R+PCA-M组、H/R+PCA-H组TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见图2及表4。

图2 各组心肌细胞TLR4/NF-κB通路蛋白表达条带图

表4 各组心肌细胞TLR4/NF-κB通路蛋白表达比较

2.5 PCA通过调控TLR4/NF-κB通路对H/R诱导的心肌细胞活力、凋亡的影响 与H/R+PCA组比较，H/R+PCA+PDTC组细胞活力、Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见图3及表5。

图3 PCA通过调控TLR4/NF-κB通路对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响(A为流式细胞仪检测两组细胞凋亡率；B为凋亡相关蛋白表达条带图)

表5 两组心肌细胞活力、细胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达比较

2.6 PCA通过调控TLR4/NF-κB通路对H/R诱导的心肌细胞氧化应激和炎症反应的影响 与H/R+PCA组比较，H/R+PCA+PDTC组LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α明显降低(P<0.05)。详见表6。

表6 两组心肌细胞氧化应激和炎性因子比较

3 讨 论

心肌缺血再灌注是因为冠状动脉阻塞、供血不足一段时间后，心肌重新恢复灌注引起的心肌细胞损伤，近年来，在我国心血管疾病病人发病年龄呈年轻化趋势，受饮食习惯、吸烟、环境和精神等众多因素的影响[8-9]。本实验通过建立心肌细胞H/R模型，发现在H/R条件下，心肌细胞的活力受到抑制，细胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显增加，Bcl-2蛋白表达减低，Bax蛋白表达增加，提示心肌细胞H/R模型构建成功。Bcl-2和Bax属于Bcl-2家族的成员，在细胞凋亡的线粒体途径中起着核心的作用，多种疾病中Bcl-2表达升高起到抗凋亡的作用，而Bax表达下调起到促凋亡的作用[10-11]。LDH是一种氧化还原酶，大多存在于肾脏器官中，其次是心肌组织和骨骼，LDH含量的高低可以反映氧化损伤的程度[12-13]。MDA在机体内抗氧化过程中具有重要作用，若机体内氧自由基大量增多，导致过氧化物含量增加，可以间接反映氧化损伤[14]。炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α参与多种细胞的炎症反应，在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达增加，在病理状态下加重细胞的炎性损伤[15]。PCA作为一种局部麻醉药，在多种抗肿瘤方面取得了明显的作用效果[16]。本研究结果显示，经过PCA处理细胞后，与H/R模型组比较，PCA各剂量组细胞活力明显增加，细胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显降低，Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达降低，这说明PCA可以明显减缓H/R诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，并提高细胞活力。

TLR4/NF-κB信号通路是心肌缺血再灌注损伤研究中经典的信号通路，TLR4异常激活后可以启动MyD88蛋白表达增加进入细胞内，促进下游NF-κB蛋白的活化，促进炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6释放，造成心肌细胞的炎性损伤[17-18]。TLR4、NF-κB在H/R诱导的心肌细胞中表达上调，抑制TLR4/NF-κB可以减缓H/R诱导的心肌细胞的凋亡和炎症反应[19]。刘婷婷等[20]研究结果显示，氧化苦参碱通过抑制NF-κB信号通路减缓H/R诱导的凋亡和氧化应激，起到保护心肌细胞的作用。花旗松素能够抑制NF-κB信号通路减缓H/R诱导心肌炎性细胞浸润明显，抑制心肌细胞的凋亡[21]。本研究结果显示，在H/R模型中，TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα在心肌细胞中表达上调，经过PCA处理后，PCA各剂量组TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达下调，说明PCA可以抑制TLR4/NF-κB通路表达。进一步实验结果显示，通过加入NF-κB通路抑制剂PDTC后，细胞活力明显增加，而细胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表达受到抑制，Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达减低，说明PCA通过抑制TLR4/NF-κB的表达发挥作用。

综上所述，PCA能够减缓H/R诱导的心肌细胞损伤，其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路有关。