天麻干预脑缺血后星形胶质细胞损伤的作用机制研究

顾卫卫，曹磊磊，施盈盈，朱 慧

天麻是一味常用而较名贵的中药，临床上广泛应用于头晕症、神经衰退、血管神经性头痛。近年来，天麻开始应用于治疗缺血性脑卒中。缺血性脑卒中的发病原因为脑部血液供应障碍，是老年人最为多见的疾病之一，具有较高的致残率及致死率。随着社会的老龄化进展，缺血性脑卒中是其中一种比较高发和严重的慢性疾病，导致神经功能障碍以及不可逆转的脑损伤。缺血性脑卒中损伤机制复杂，涉及能量代谢、钙超载、自由基损伤、炎症反应及细胞凋亡等。目前主要采用抗凝、溶栓、抗血小板以及神经保护治疗中风[1-2]。现在很多人都热衷于神经保护药，因为保护神经的药物能使大脑更能对抗中风引起的损伤。近年来越来越多的研究开始专注于传统中药，天麻就是其中一种受人们热捧的传统中药，具有镇静、抗惊厥等多种药理活性[3]。天麻所具有的神经保护作用备受研究者的关注[4-8]。在我国天麻用于治疗缺血性脑卒中病人，疗效确切，并能明显改善病人的行为障碍[9]。前期研究发现，连续给予天麻28 d，可减小缺血性脑卒中大鼠的脑梗死面积，改善其行为学症状，降低凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的表达水平，所以推测天麻对缺血性脑卒中病人的保护作用可能与Cathepsin B-Caspase通路有关。本研究探讨天麻对脑缺血后星形胶质细胞损伤是否具有直接保护作用及Cathepsin B-Caspase信号通路与天麻保护细胞的作用有无关联。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要药品与试剂 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量300 g左右，不超过±10%。天麻纯度 98.0%，红四氮唑(TTC)，水合氯醛，抗体：Anti-GFAP(Millipore)、β-actin(Sigma)、anti-CathepsinB(MILLIPORE)、Anti-Caspase-3(MILLIPORE)。

1.2 主要实验仪器 自动加热垫；电子天平；标准脑立体定位仪；电子显微镜；大鼠抓力测定仪；电泳仪；电泳槽；离心机；超声细胞破碎仪；恒温电热水浴锅。

1.3 溶液配制 天麻的配制：10 g天麻溶于500 mL生理盐水，然后再稀释成4 mg/mL，常温保存。4%TTC：称取TTC 4 g，加入蒸馏水中，定容至100 mL，存放于4 ℃。4%多聚甲醛溶液：称取多聚甲醛80 g，50 ℃水浴，溶解于800 mL蒸馏水，待完全溶解后，加入磷酸缓冲盐溶液，调节pH 值为7.2～7.4，蒸馏水定容至2 000 mL，4 ℃冷藏保存。

1.4 缺血再灌注模型的建立 麻醉大鼠，固定好，切开颈部，分离出右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，扎紧颈外动脉以及颈总动脉的近心端，用动脉夹夹住远心端，然后在此中间部位剪一小口，插入尼龙线，松开动脉夹，慢慢地将尼龙线推进血管内8～19 mm，使得大脑中动脉缺血，缺血2 h后，将尼龙线去除，脑部血流再灌注。假手术组同样经过以上过程但不插线。缺血再灌注28 d对大鼠进行行为学测试以及神经症状评分[10-13]。天麻持续治疗28 d后，取大鼠大脑、小脑、低位脑干以及嗅球去除，然后冠状切为5片，每片厚度一致。然后用TTC染色，37 ℃避光染色30 min。染色完毕之后，再将脑片放入4%甲醛固定，固定完后取出脑片吸干或晾干，红色的为正常组织，白色的为缺血坏死组织，拍照，使用SigmaScan Pro 5软件分析缺血梗死体积，脑梗死体积=梗死脑组织体积/右脑体积。

1.5 分组方法及指标检测

1.5.1 蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定大鼠大脑皮层胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Cathepsin B、Caspase-3表达 选取50只健康雄性大鼠，随机分为假手术组、模型组、天麻低剂量(50 mg/kg)组、天麻中剂量(100 mg/kg)组、天麻高剂量(150 mg/kg)组，每组10只。天麻各剂量组和模型组均进行缺血再灌注手术，模拟人的缺血性脑卒中，假手术组进行假手术，不插线，其他操作都相同。天麻各剂量组每天给大鼠灌胃1次，天麻连续给药28 d，模型组灌胃同体积溶剂。天麻连续给药28 d后，取缺血区脑组织，Western Blot法检测各组GFAP及凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3表达水平。

1.5.2 天麻对氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)诱导的星形胶质细胞乳酸脱氢酶(LDH)的影响 细胞培养板中接种上星形胶质细胞，为了观测天麻对正常培养的星胶细胞生长有无影响，除了OGD/R组给予天麻处理外，正常培养组也给予相应的天麻处理，总共分为8组，分别为对照组(non-OGD组)、non-OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、non-OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、non-OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组、OGD/R组[氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)2 h，再给予正常培养基，恢复供氧]以及OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组，每组有3个复孔。给药要求提前0.5 h，OGD处理时以及更换培养基时给予相应剂量的天麻。OGD/R结束后，细胞损伤程度测定采用LDH法。

1.5.3 Western Blot法测定OGD/R诱导的星形胶质细胞中GFAP、Cathepsin B、Caspase-3表达变化 原代培养的星胶细胞分为non-OGD组、non-OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、non-OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、non-OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组、OGD/R组以及OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组。给药提前0.5 h，OGD处理时以及更换培养基时给予相应剂量的天麻。OGD/R结束后，采用Western Blot法检测各组GFAP、Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 天麻对缺血再灌注大鼠行为学神经症状的影响

2.1.1 神经症状评分 模型组神经症状评分为(3.00±0.67)分，天麻低、中、高剂量组神经症状评分分别为(2.90±0.57)分、(2.80±0.63)分、(2.40±0.52)分。天麻高剂量组神经症状评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

2.1.2 抓力测试 模型组前肢抓力(90.87±13.07)g，假手术组前肢抓力(175.72±4.17)g，模型组前肢抓力明显低于假手术组(P<0.01)。天麻低、中、高剂量组前肢抓力分别为(92.36±11.19)g、(102.97±12.12)g、(108.45±13.55)g，天麻中、高剂量组前肢抓力高于模型组(P<0.01)。详见图1。

2.1.3 圆桶测试 圆桶测试按右前肢的使用次数占总使用次数的百分比计算，模型组圆桶测试值为0.81±0.12，假手术组圆桶测试值为0.01±0.06，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。天麻低、中、高剂量组圆桶测试值为分别为0.80±0.08、0.74±0.11、0.68±0.08，天麻高剂量组圆桶测试值明显低于模型组(P<0.05)。详见图1。

与假手术组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01。

2.2 天麻对缺血性再灌注大鼠脑梗死体积的影响 模型组脑梗死体积为(52.66±2.39)%，天麻低、中、高剂量组脑梗死体积分别为(38.61±1.89)%、(28.48±3.80)%、(14.95±1.34)%，与模型组相比，天麻低、中、高剂量组脑梗死体积明显缩小(P<0.01)。详见图2、图3。

图2 各组TTC染色的切片图(A为假手术组；B为模型组；C为天麻低剂量组；D为天麻中剂量组；E为天麻高剂量组。白色为缺血坏死部分)

与模型组比较，＊P<0.01。

2.3 天麻对缺血再灌注诱导的皮层缺血区及OGD/R诱导的星形胶质细胞中GFAP、LDH的影响 Western Blot检测结果显示，模型组 GFAP蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)，天麻中、高剂量组GFAP蛋白表达高于模型组(P<0.01)。在体外试验中，OGD/R组GFAP蛋白表达明显低于non-OGD组(P<0.01)，OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组GFAP蛋白表达明显高于OGD/R组(P<0.01)。LDH漏出率升高，代表细胞受到损伤，即LDH值越高，细胞损伤程度越高。为了证明天麻对缺血脑细胞的保护作用，特别是缺血星形胶质细胞的保护作用，采用LDH法测定OGD/R 24 h 后LDH漏出率。与正常培养的细胞相比，OGD/R组 24 h LDH漏出率明显升高。随着给药剂量的增加，LDH漏出率逐渐降低，OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组LDH漏出率低于OGD/R组(P<0.05或P<0.01)。详见图4、图5。

与假手术组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

与non-OGD组比较，＊P<0.01；与OGD/R组比较，#P<0.05，△P<0.01。

2.4 天麻对缺血再灌注诱导的大脑皮层缺血区Cathepsin B、Caspase蛋白表达的抑制作用 Western Blot检测结果显示，模型组缺血区Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达水平明显高于假手术组(P<0.01)，天麻低、中、高剂量组大脑皮层缺血区Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。详见图6、图7。

与假手术组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01。

与假手术组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01。

2.5 天麻对OGD/R 诱导的凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的影响 non-OGD组Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达水平较低，但经OGD/R处理后，与这两种凋亡蛋白明显激活，OGD/R组Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达较non-OGD组明显升高(P<0.01)，OGD+天麻小剂量(0.1 μmol/L)组、OGD+天麻中剂量(1 μmol/L)组、OGD+天麻大剂量(10 μmol/L)组Cathepsin B、Caspase-3蛋白表达明显低于OGD/R组(P<0.05或P<0.01)，提示天麻(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)可有效地降低OGD/R诱导的星形胶质细胞中Cathepsin B、Caspase-3的蛋白表达。详见图8、图9。

与non-OGD组比较，＊P<0.01；与OGD/R组比较，#P<0.05，△P<0.01。

与non-OGD组比较，＊P<0.01；与OGD/R组比较，#P<0.01。

3 讨 论

缺血性脑卒中是严重的致残和致死疾病，会引起严重的脑损伤以及行为学障碍。有文献报道，在大鼠大脑创伤性损伤模型以及心肌缺氧缺血模型中，长期给予天麻，能改善行为学症状，明显减小坏死灶体积[14]，也有文献报道天麻可以明显地抑制继发性炎症[15]。以往研究着重于缺血急性期的大脑病理学变化，但现在开始关注缺血的亚急性期或者更长的一段时间[16-17]。缺血引起的水肿一般发生在急性期内，但脑体积缩小或者萎缩一般会经历较长的一段时间，这个观点在目前的研究中也得以证实。缺血再灌注后，长期给予天麻，可明显改善大鼠行为学症状，两前肢得以平衡使用，且明显增强前肢抓力力度，通过染色统计分析，白色梗死体积明显缩小，提示对于缺血性脑损伤模型，天麻具有脑保护作用。但是其具体的作用机制尚未明确。武海云等[18]研究证实，天麻素可以通过抑制脑缺血大鼠大脑皮质细胞中 p38 蛋白磷酸化水平，降低磷酸化及抑制活性 Caspase-3蛋白表达，Caspase-3能催化许多关键蛋白的裂解，细胞凋亡坏死时，其常被激活。高浓度谷氨酸能够激活Caspase-3蛋白的表达，武海云等[18]的实验中谷氨酸处理组Caspase-3蛋白激活，给予天麻素72 h后Caspase-3蛋白表达量与谷氨酸处理组相比明显降低，提示天麻素可抑制谷氨酸诱导的凋亡，其机制可能与Caspase-3依赖性途径发生的凋亡相关。基于以上的理论基础及研究进展，在大鼠的脑缺血再灌注模型以及细胞的OGD/R模型上观察天麻对星形胶质细胞的保护作用，及其对Cathepsin-caspase 信号通路的影响。本实验研究证明，大鼠脑缺血再灌注以后，溶酶体酶Cathepsin B以及Caspase-3表达明显升高，天麻能有效地降低溶酶体酶Cathepsin B以及Caspase-3的表达水平。同时在体外试验中也证实了天麻对Cathepsin B、Caspase-3激活的抑制作用。本实验证实了天麻对缺血性脑卒中的治疗疗效，且通过体外体内模型试验，阐明天麻可能通过抑制Cathepsin B Caspase的细胞凋亡途径，从而对损伤的脑细胞发挥保护作用，为缺血性脑卒中疾病的治疗提供了潜在的药物靶点。