基于网络药理学分析杞菊地黄丸治疗高血压的作用机制

陈晶晶，马晓昌

高血压是指以体循环动脉压升高为主要特征的最常见的慢性非传染性疾病。根据《中国心血管病报告2018》[1]，我国高血压病的患病率持续上升，而治疗率和控制率处于较低水平，成人高血压粗患病率为27.9%[2]，控制率仅为7.2%[3]，是我国面临的重要公共卫生问题。中医古籍虽无高血压之名，但可将其归属于中医“眩晕”“头痛”等范畴，多因机体阴阳失衡、肝肾亏虚、阴虚阳亢而致，治疗多以补益肝肾为法。杞菊地黄丸由枸杞子、菊花、山茱萸、山药、熟地黄、牡丹皮、泽泻、茯苓八味药组成，具有补肾养肝、滋阴潜阳之功效。临床研究表明，杞菊地黄丸治疗高血压的疗效显著，具有抗炎、抗氧化和改善血管舒缩功能的作用[4-5]，但其药效物质基础和具体作用机制尚不明确。因此，系统研究杞菊地黄丸治疗高血压的作用机制具有积极意义。

网络药理学是基于药理学、生物信息学和系统生物学等相关学科，运用计算机虚拟计算技术而发展出的一门学科，可深入探索中药及中药复方多成分、多靶点、多通路的作用机制，尤其适用于研究中药及其复方[6]。本研究通过网络药理学从分子水平阐明杞菊地黄丸的药物活性成分、作用靶点以及与高血压之间的相互作用关系，以期为其进一步的药理作用和临床应用提供理论依据和研究方向。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选 以“枸杞”“菊花”“地黄”“山药”“山茱萸”“泽泻”“茯苓”“牡丹皮”为主题词，在中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中检索药物活性成分，以类药性(drug likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%为筛选条件，筛选出符合条件的活性成分进行分析。

1.2 靶点收集 将在TCMSP数据库中检索得到的药物活性成分作用靶点导入UniProt数据库，将所有人源靶点蛋白名称校正为其官方名称。在GeneCards数据库中以“hypertension”为关键词进行检索，将检索结果中相关度得分≥20分的靶点作为高血压疾病靶点进行研究，同时摘录疾病靶点的标准基因名称。

1.3 构建Venn图 将杞菊地黄丸药物活性成分的作用靶点与高血压相关靶点分别导入Venny在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools//venny/)，生成Venn 图，获得疾病与药物共同作用靶点。

1.4 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络 将获得的疾病与药物共同作用靶点导入STRING 11.0，选择研究物种为人类，置信度为0.400，获取蛋白相互作用关系数据，再将数据导入Cytoscape 3.8.0软件，构建PPI网络。

1.5 构建药物活性成分-疾病靶点的可视化网络 将获得的疾病与药物共同作用靶点导入Cytoscape 3.8.0软件，构建药物活性成分-疾病靶点的可视化网络。

1.6 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 利用David数据库将药物-疾病共同靶点进行GO、KEGG富集分析。

2 结 果

2.1 药物活性成分筛选结果 本研究基于样本量和数据复杂性考虑，将OB、DL参数作为化学成分药物代谢性质(ADME)筛选条件，筛选后得到139个药物活性成分，包括45个枸杞活性成分、20个菊花活性成分、2个地黄活性成分、16个山药活性成分、20个山茱萸活性成分、15个茯苓活性成分、10个泽泻活性成分、11个牡丹皮活性成分。

2.2 靶点收集 在TCMSP数据库中检索得到1 456个杞菊地黄丸药物活性成分的作用靶点，删除重复项并通过UniProt 数据库校正名称后得到235个靶点。在GeneCards数据库中检索到7 814个疾病靶点，相关度得分≥20分的靶点有174个，其中相关度较高的靶点是骨形成蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2)、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)，其中BMPR2相关度得分为124.2分，ACE 为86.26分，AGT 为63.82分。

2.3 药物与疾病交集靶点的Venn图 对杞菊地黄丸活性成分作用靶点及高血压疾病靶点取交集，构建Venn图，共得到29个药物与疾病交集靶点(见图1)，包括核受体亚家族3 c族成员2(NR3C2)、β2-肾上腺素能受体(ADRB2)、β1-肾上腺素受体(ADRB1)、溶质转运家族6成员4(SLC6A4)、过氧化物酶体增殖物激活受体G(PPARG)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、原癌基因FOS(FOS)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白细胞介素 6(IL6)、血红素加氧酶1(HMOX1)、小窝蛋白1(CAV1)、凝血因子Ⅲ(F3)、缝隙连接蛋白α1(GJA1)、CC型趋化因子配体2(CCL2)、E选择素(SELE)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、组织型纤溶酶原激活物(PLAT)、血栓调节蛋白(THBD)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、溶质转运家族2成员4(SLC2A4)、C反应蛋白(CRP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、过氧化氢酶(CAT)、载脂蛋白B(APOB)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)。

图1 疾病与药物交集靶点Venn图

2.4 PPI网络 构建PPI网络(见图2)，该网络包括29个节点、224条边，节点表示蛋白，节点大小和颜色深浅代表节点连接度(Degree)的大小，节点越大、颜色越深则Degree值越大；边表示蛋白之间的相互关系，边的粗细代表combined score值的大小，边越粗combined score值越大。由图中可见连接度较高靶点蛋白是NOS3、IL6、CCL2、VEGFA、MMP9、SERPINE1、PPARG、MMP2、EGFR、CRP、FOS等。

图2 PPI网络图

2.5 药物活性成分-疾病靶点可视化网络 将获得的药物与疾病交集靶点导入Cytoscape 3.8.0软件构建可视化网络(见图3)，该网络包括89个节点、158条边，图中长方形代表药物活性成分(见表1)，包括15个枸杞活性成分，11个菊花活性成分，7个山药活性成分，4个山茱萸活性成分，3个茯苓活性成分，5个泽泻活性成分，1个牡丹皮活性成分以及6个多种药物共同的活性成分；中央椭圆形代表疾病靶点。药物活性成分中节点连接度最高的是MOL000098槲皮素(quercetin)，疾病靶点中节点连接度最高的是NR3C2。

图3 药物活性成分-疾病靶点可视化网络

表1 杞菊地黄丸药物活性成分

2.6 GO、KEGG富集分析 GO功能分析结果显示，主要与蛋白异源二聚体活性、一氧化氮合酶结合、丝氨酸水解酶活性等有关。KEGG富集分析结果显示，与高血压有关的通路主要为流体剪切应力和动脉粥样硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并发症的糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication)、缺氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)信号通路、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、钙离子信号通路(calcium signaling pathway)等。将分析结果以P值降序排列，取排名前20的条目构建气泡图，图中节点的大小表示富集基因数量多少，节点的颜色由红色至绿色表示P值由大到小。详见图4、图5。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集分析

3 讨 论

滋肾养肝法是治疗高血压病的重要方法之一。杞菊地黄丸出自《医级·卷八》，方中枸杞滋补肝肾；菊花清肝热；熟地黄滋补肾阴；山药补益脾肾；山萸肉滋补肝肾；泽泻祛湿降浊；茯苓健脾祛湿；丹皮清热凉血。诸药合用，共奏滋肾养肝之功，可有效调节机体阴阳，控制血压。本研究分析显示，杞菊地黄丸治疗高血压的主要药理成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是具有多种生物活性的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和心血管保护作用，能降低内皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平和自发性高血压大鼠的血压[7-8]。木犀草素能降低自发性高血压大鼠血压，使自发性高血压大鼠心肌组织中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)和ET-1表达降低，一氧化氮(nitric oxide，NO)表达升高[9]。

KEGG富集分析结果显示，流体剪切应力信号通路、AGE-RAGE信号通路、松弛素信号通路、钙离子信号通路和HIF-1信号通路等与高血压密切相关。高血压的基本病理变化包括血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖及血管重构等[10]。血流剪切力是血液流经血管壁面时产生的摩擦力，可通过激活机械感受器、特异性转录因子、细胞内信号通路以及基因和蛋白的表达等途径调节内皮细胞功能[11]。高血压病人血流动力学改变引起剪切力变化，促使血管内皮细胞损伤，引起血管内皮功能障碍，NO等血管舒张因子合成减少，ET-1等血管收缩因子合成增加，促进血管收缩，血压升高。AGE及RAGE与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)、氧化应激之间形成正反馈，参与高血压的发生发展。AGE与内皮细胞表面受体结合后，促使ET-1合成增加，ET-1是目前已知的收缩血管作用最强的物质，血管收缩致血压升高[12]。HIF-1是机体在低氧状态时产生的一种核转录因子，是由调节亚基α和构造亚基β组成的异二聚体。HIF-1α信号通路的激活可通过影响RAAS系统和交感神经系统活性调节血压。长期慢性缺氧可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，同时清除NO，致血管舒张功能障碍，从而导致血压升高。ROS可通过增加血管紧张素原的合成，激活肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)[13]。松弛素是一种双链蛋白质，可抑制ET-1和AngⅡ等缩血管物质，同时能增加血管内皮基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)活性，通过将内皮细胞合成释放的ET-1降解为内皮素，激活内皮素B型受体，促使内皮释放NO，产生血管扩张效应[14]。钙离子信号通路可通过调控血管平滑肌收缩、增殖等过程参与高血压的病理过程[15]。血管收缩力与收缩蛋白对Ca2+的敏感性和胞浆中Ca2+浓度有关，Ca2+可通过兴奋-收缩耦联调控血管平滑肌张力和小动脉阻力来调节血压。PPI网络中连接度较高的靶点蛋白是MMP9、MMP2、VEGFA、NOS3、IL6、CRP等。MMP是一组能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶，可通过影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的结构和功能从而引起动脉重构，通过释放VEGF参与血管生成。研究表明，原发性高血压病人血清MMP9水平明显高于血压正常者，且MMP9水平与大动脉硬度呈正相关[16]，与高血压左心室肥厚呈正相关，也与左心室舒张功能障碍密切相关[17]。VEGF是一种能促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移和增殖的促血管内皮细胞生长因子。在高血压病人中VEGF水平明显升高，在血压未控制的病人中其升高水平更明显，且VEGF水平和收缩压水平成正比[18]。VEGF与其受体VEGFR-2结合后，通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径[19]诱导生成内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，NO表达上调，血管扩张，从而调节血压。

炎症在高血压的发生发展中有重要作用。本研究KEGG富集分析中肿瘤坏死因子信号通路和IL-17信号通路，PPI网络中IL-6和CRP是与高血压有关的重要炎性因子。长期血清炎性因子水平过高可诱导血管微环境稳态失衡，直接损伤血管内皮细胞，促使单核-巨噬细胞浸润，黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)等血管活性物质的分泌明显增加，促进内皮细胞增殖、迁徙和分化，致使血管结构和功能改变，同时NO等内皮依赖性舒血管物质生成和分泌减少，血管阻力增加，血压升高[20]。Bautista等[21]研究表明，高血压病人血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6水平明显高于血压正常者，且TNF-α和IL-6是高血压的独立危险因素。TNF-α是由单核-巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等生成的一类多肽类炎性细胞因子，可直接或间接损伤血管内皮细胞，减少NO的生成，促进平滑肌细胞增殖[22]，导致高血压发生。IL-6是由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞等分泌的炎性细胞因子，能调节CRP的表达，促进血管平滑肌细胞增殖，增加平滑肌细胞内Ca2+浓度，促进血管收缩。IL-6基因低甲基化能增加原发性高血压的患病风险[23]。

本研究基于网络药理学对杞菊地黄丸治疗高血压进行化合物、靶点、GO及KEGG通路分析，建立了杞菊地黄丸药物活性成分-疾病靶点网络、PPI网络，从多个角度探索杞菊地黄丸治疗高血压的分子物质基础和作用机制，体现了中药“多成分-多靶点-多途径”的作用特点，以期为药物的临床使用和进一步研究提供理论基础。