IL-6、STAT3在糖尿病视网膜病变大鼠中的表达及曲克芦丁水溶液治疗对其水平的影响

杨馥宇，刘 辉，苏 杰，王 玲，王林洪

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy， DR)发病率为24%～70%，普遍认为其发生与氧化应激、免疫/炎症、基因多态性等理论有关，随着研究不断深入，部分学者指出免疫/炎症理论在DR发生发展中起着重要作用[1-2]。白细胞介素-6(IL-6)为多效性细胞因子，动物实验及体外实验均已证实，IL-6在DR大鼠或患者外周血、视网膜组织中呈异常高表达[3-4]。而高水平IL-6可持续刺激磷酸化信号转导与转录激活因子3(STAT3)，激活小胶质细胞，分泌过量IL-6，加剧视网膜神经节细胞凋亡[5]。由此可见，调控IL-6、STAT3表达有望减轻DR患者炎症反应，延缓病情进展。曲克芦丁具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等诸多优势，但从IL-6、STAT3分子层面分析其在DR大鼠中应用效果的研究较少。本研究建立DR大鼠模型，观察IL-6、STAT3蛋白变化及曲克芦丁水溶液的治疗效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 曲克芦丁水溶液(神威药业集团有限公司，国药准字H13023722)；IL-6、STAT3试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；血糖测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2实验动物 健康雄性大鼠60只，购自北京华阜康公司，体质量200～220 g，饲养于25 ℃环境下，空气流通，12 h光照维持，采用鼠全价颗粒饲料适应性喂养5 d。

1.3模型建立 将1.5 g链脲佐菌素溶于2% 0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.6)，大鼠空腹12 h后，以50 mg/kg剂量进行腹腔穿刺，回抽针栓，无气体、血液后注入药物，造模3 d监测血糖变化，当空腹血糖(FPG)>16.5 mmol/L时，判定为DR模型制备成功[6]。

1.4动物分组及治疗 取20只大鼠为正常组，每天给予生理盐水100 mg/kg灌胃。建立DR模型后，随机分为模型对照组和曲克芦丁水溶液组，各20只。模型对照组每天给予生理盐水100 mg/kg灌胃，曲克芦丁水溶液组每天给予曲克芦丁水溶液100 mg/kg灌胃。灌胃12周后剔除生理状态差、体质量差异大及死亡大鼠，后于3组中随机选取12只大鼠行实验研究。

1.5标本采集 治疗12周后，过量麻醉处死大鼠，取大鼠完整眼球，分离眼周围软组织，取出并剪开眼球，去除房水及晶状体，充分暴露视网膜，清洗干净后放入试管，液氮冻存。

1.6视网膜组织IL-6、STAT3测定 视网膜组织称重后，采用冰浴研磨法制作10%组织匀浆，二辛可宁酸法检测10%组织匀浆总蛋白浓度，样本稀释液稀释，调整各样本总蛋白浓度，采用酶联免疫吸附试验测定IL-6蛋白含量。采用蛋白免疫印迹法测定STAT3水平。TRIzol法提取视网膜组织总蛋白，提取的每只大鼠视网膜组织等量加入100 μl裂解液，反复过滤、离心，取30 μg样本，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，37 ℃环境封闭2 h，加入稀释500倍的STAT3抗体，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲溶液冲洗后与二抗结合，孵育1 h后显色，蛋白相对表达水平以目的蛋白条带灰度与内参的比值表示。

1.7大鼠视网膜组织形态及视网膜神经节细胞凋亡指数 摘取大鼠眼球后，常规固定、脱水、浸蜡包埋，切片厚度4 μm，应用光镜及透射电镜观察视网膜各层结构及细胞形态，记录视网膜神经节细胞凋亡数目，应用IPP 6.0图像分析软件分析染色结果，计算视网膜神经节细胞凋亡指数。视网膜神经节细胞凋亡指数=凋亡细胞数量/细胞总数量×100%。

1.8血糖测定 于大鼠尾部穿刺取血，应用全自动生化分析仪测定FPG、糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

2 结果

2.1大鼠一般情况 正常组大鼠体形适中，精神状态良好，毛发光泽，反应灵敏，晶状体透明；模型对照组和曲克芦丁水溶液组大鼠体形消瘦，精神萎靡，腹部肥大，毛发欠光泽，易脱毛，动作迟缓，晶状体浑浊，甚至晶状体皮质溶解，角膜边缘新生血管生长。

2.2大鼠视网膜组织形态 光镜下，正常组视网膜组织结构正常，各层细胞排列规则，外颗粒层感光细胞分布均匀，内颗粒层细胞结构清晰，各层纤维结构无异常；模型对照组视网膜水肿，内核层、外核层细胞间水肿，细胞排列紊乱；曲克芦丁水溶液组视网膜厚度接近正常，外核层细胞间稍疏松，排列较整齐。透射电镜下，正常组大鼠视网膜显微结构无异常，模型对照组可见细胞外节内膜盘排列紊乱，含糖原颗粒沉淀，早期色素上皮细胞微绒毛脱落，内质网扩张；曲克芦丁水溶液组可见外节内膜盘排列整齐，色素上皮细胞微绒毛排列稀疏，细胞膜内褶排列紧密。

2.3大鼠血糖测定结果 造模3 d后，曲克芦丁水溶液组、模型对照组FPG、HbA1c高于正常组(P<0.05)，但曲克芦丁水溶液组与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后，曲克芦丁水溶液组、模型对照组FPG、HbA1c高于正常组，但低于同组造模3 d后(P<0.05)；治疗12周后，曲克芦丁水溶液组FPG、HbA1c低于模型对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠血糖测定结果比较

2.4大鼠视网膜组织IL-6、STAT3水平及视网膜神经节细胞凋亡指数 曲克芦丁水溶液组、模型对照组视网膜组织IL-6、STAT3水平及视网膜神经节细胞凋亡指数高于正常组，且曲克芦丁水溶液组低于模型对照组(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠视网膜神经节细胞凋亡指数及视网膜组织IL-6、STAT3水平比较

3 讨论

调查显示，糖尿病病程>10年者眼底病变发病率为69%～90%，以DR尤为常见[7-8]。因此，本研究建立大鼠DR模型，造模3 d后模型对照组和曲克芦丁水溶液组FPG水平均>16.5 mmol/L，分别给予生理盐水、曲克芦丁水溶液灌胃，治疗12周后，曲克芦丁水溶液组FPG、HbA1c水平均低于模型对照组，考虑与曲克芦丁水溶液具有抗炎、抗氧化作用有关，可显著减轻炎症、氧化应激所致胰岛素抵抗，起到控制血糖的目的，但具体机制不明。

传统观念认为，血-视网膜屏障破坏及微血管病变是DR早期典型特征。新近研究指出，典型视网膜微血管改变前，机体已出现视功能减退及视神经损伤，表现为色觉、对比敏感度、视网膜电图等异常[9-10]。研究表明，1型糖尿病大鼠模型建立4周后出现神经细胞丢失与凋亡[11]。神经节对细胞损伤及神经毒性作用高度敏感，可为DR早期病变鉴别诊断提供有利依据，尽早抑制视网膜神经节细胞凋亡是控制DR病情进展关键环节。

研究表明，免疫炎症是DR发病重要机制，调控免疫炎症有望控制疾病进展，但关于免疫炎症产生的确切分子机制尚不完全清楚[12]。IL-6/JAK2/STAT3信号通路激活可促使B细胞分化为浆细胞，刺激IL-6自分泌，形成正前馈循环，扩大炎症反应，在糖尿病、DR等疾病中扮演重要角色[13]。IL-6主要作用为促进血管活性物质分泌、介导炎症纤维蛋白表达。当前研究证实，高水平IL-6是DR发生的独立危险因素[14]。长期高血糖环境下，胰岛细胞可合成大量IL-6，激活一系列炎症和免疫应答反应，产生细胞毒性作用，加重胰岛素抵抗，增加DR发生的风险[15-16]。同时IL-6可结合靶细胞表面IL-6受体(sIL-6R)，形成sIL-6R/IL-6复合物，活化细胞膜表面糖蛋白130，刺激JAK2，活化受体酪氨酸激酶，结合STAT3蛋白，促进STAT3磷酸化。磷酸化的STAT3可刺激核因子-κB(NF-κB)，使其转移至细胞核后，释放过量炎性因子，正反馈作用于NF-κB，促进炎症反应，加剧视网膜组织损伤[17-18]。另外缺氧条件下，STAT3高表达会启动血管内皮生长因子转录，诱发基底膜增厚、微动脉瘤形成、新生血管形成等一系列病理变化，最终演变为DR[19]。因此，调控IL-6/JAK2/STAT3信号通路有望成为临床治疗DR的靶点之一。

曲克芦丁是芦丁衍生物，其治疗DR机制为，抑制血小板聚集，阻断血栓形成；抑制Fenton反应及脂质过氧化链式反应，产生明显抗脂质过氧化作用；减少活性氧生成，抑制炎症激活，发挥抗炎作用[20]。本研究显示，曲克芦丁水溶液组视网膜组织IL-6、STAT3水平及视网膜神经节细胞凋亡指数低于模型对照组。提示曲克芦丁水溶液可通过调节IL-6/JAK2/STAT3信号通路减轻炎症反应，阻碍视网膜神经节细胞凋亡，保护视网膜毛细血管，促进DR病情转归。仍需注意的是，曲克芦丁水溶液组各指标均与正常组存在一定差异。提示曲克芦丁水溶液治疗DR大鼠效果仍存在一定局限性，建议后续通过延长曲克芦丁水溶液治疗时间、增加曲克芦丁水溶液剂量等方面进行更深入研究。

综上所述，DR大鼠视网膜组织IL-6、STAT3呈高表达，经曲克芦丁水溶液治疗后其水平降低，但本研究仅采取实验性DR大鼠展开研究，建议将来通过体外研究进一步探讨曲克芦丁水溶液治疗DR的作用靶点及关键机制。