微小RNA-9在子宫内膜癌组织中表达及意义

陈小霞，谢环，李晓兰

作者单位：三峡大学宜昌市第二人民医院妇产科，湖北 宜昌 443000

子宫内膜癌发病率呈上升趋势、发病年龄出现年轻化［1］，对女性生命安全构成了严重威胁。尽管现有的临床诊疗手段不断进步，早期子宫内膜癌病人经规范化治疗后，总体生存期不断延长［2］，但对于进展期或转移复发的病人，预后依然较差，病死率较高［3］。因此，积极探讨影响子宫内膜癌发生、进展的早期标志物，对该肿瘤早期诊疗及预后改善具有重要意义。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一种在转录后水平通过与mRNA 靶序列结合而实现对靶基因的负性调控的非编码RNA，可在多种生理、病理过程中发挥重要作用［4］。近年来发现［5］，miRNA 与多种恶性肿瘤发生及进展密切相关。有研究指出［6］，子宫内膜癌干细胞分化过程中部分miRNA的表达具有显著性变化。miR-9 作为一种miRNA，可在体内多种组织中表达并发挥重要作用［7］。本研究检测了miR-9 在子宫内膜癌组织中表达情况，分析了与临床病理指标及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012 年4 月至2014 年4 月在三峡大学宜昌市第二人民医院行手术治疗的子宫内膜癌病人，纳入标准：术前未接受放化疗、内分泌治疗；术后病理明确为子宫内膜癌；术前无内分泌、免疫、代谢性疾病；未失访，资料完善。排除标准：转移性子宫内膜癌；合并有其他恶性肿瘤。共纳入97例，年龄（54.67±9.67）岁，范围为34～73岁。体重指数（BMI）（25.35±2.67）kg/m2，按照国际妇产科联盟（FIGO）2009 年标准：Ⅰ～Ⅱ期56 例，Ⅲ～Ⅳ期41例；36 例出现淋巴结转移。同期，留取因子宫肌瘤、脱垂等良性病变行子宫切除手术的正常子宫内膜组织46 份，年龄（55.39±10.15）岁，范围为32～74岁。本研究通过宜昌市第二人民医院医院伦理委员 会 批 准（ 批 准 文 号 ：HBSYCSDERMYY201108061136），所有病人均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 术 用外科剪将子宫内膜癌及正常子宫内膜组织剪碎，加入组织研磨机匀浆，按Trizol总RNA 提取试剂说明（购自美国Invitrogen 公司）提取总RNA。利用紫外分光光度计检测总RNA 浓度和纯度，合格标准：OD260/OD280在1.80～2.20。按照逆转录试剂盒（购自日本TaKaRa 公司）说明将总RNA 逆转录为cDNA，根据PCR 扩增试剂盒（购自日本TaKaRa 公司）操作步骤，用CFX96 型实时荧光定量PCR 仪（购自美国Bio-Rad 公司）对引物序列进行扩增，引物序列：miR-9 正向5’-GCGCGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG-3’，反向5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3’；U6 正向5’-CTGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。反应条件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，73 ℃30 s，循环38 次。采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-9相对表达量。

1.2.2 随访 术后第1天开始，对病人进行随访，包括门诊、电话等，随访至2019 年4 月30 日，随访2～84个月，记录病人死亡情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料采用±s，组间比较采用独立样本t 检验，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 检验，多因素因素分析采用Cox 比例风险回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中miR-9 表达比较 miR-9 在子宫内膜癌组织相对表达量为（0.25±0.10），在正常子宫内膜组织中则为（1.02±0.14），差异有统计学意义（t=38.42，P＜0.001）。

2.2 不同临床病理指标的子宫内膜癌组织中miR-9 表达比较 相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级G1～G2 期、浸润深度＜1/2 肌层、未淋巴结转移，miR-9相对表达量在Ⅲ～Ⅳ期、G3期、≥1/2肌层、淋巴结转移显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 子宫内膜癌病人不同临床病理指标中miR-9表达比较/±s

表1 子宫内膜癌病人不同临床病理指标中miR-9表达比较/±s

指标年龄＜55岁≥55岁是否绝经例数miR-9相对表达量t值1.36 P值0.177 43 54 0.23±0.10 0.26±0.10 1.82 0.073是否40 57 0.23±0.09 0.26±0.10病理学类型子宫内膜腺癌非子宫内膜腺癌FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期组织学分级G1～G2期G3期浸润深度＜1/2肌层≥1/2肌层雌激素受体阳性阴性孕激素受体阳性阴性淋巴结转移1.44 0.154 77 20 0.25±0.10 0.22±0.08 3.84＜0.001 56 41 0.28±0.10 0.20±0.09 3.76＜0.001 59 38 0.28±0.10 0.20±0.08 3.89＜0.001 55 42 0.28±0.10 0.21±0.09 1.63 0.106 66 31 0.26±0.10 0.22±0.10 1.78 0.078 61 36 0.23±0.10 0.27±0.10 3.46 0.001是否36 61 0.20±0.08 0.27±0.10

2.3 miR-9 表达对子宫内膜癌病人生存时间的影响 选取miR-9 相对表达量的P25值（0.16），病人分成低表达组（＜0.16）16 例及高表达组（≥0.16）71 例，生存分析示，低表达组生存时间低于高表达组［（34.82±5.96）个月比（69.23±3.12）个月］，累积生存率低于高表达组（24.00% 比75.00%），差异有统计学意义（χ2=28.37，P＜0.001）。

2.4 影响病人预后的因素 FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、浸润深度≥1/2 肌层、淋巴结转移和miR-9 低表达是病人预后的风险因素（HR=2.44、2.75、2.26 和0.31，P＜0.05）。

表2 子宫内膜癌97例预后影响因素的Cox比例风险回归模型

3 讨论

子宫内膜癌诱发因素较多，发病率仅次于宫颈癌，位女性生殖道恶性肿瘤第二位［8］。临床上对于早期子宫内膜癌病人的治疗主要以手术切除辅以放化疗，多数病人病情得到很好控制，5 年生存率不断提高［9］，但对于晚期及发生复发转移的病人，死亡率较高，5 年生存率不超过30%［10］。目前，对于子宫内膜癌发生、进展机制及诊疗标志物研究尚处于起步阶段，积极寻找有效的分子标志物或靶基因对明确子宫内膜癌发生、进展机制及诊疗具有重要意义。有研究指出，miRNAs 功能及表达异常与人类肿瘤发生、进展密切相关［11］。miRNAs 可在肿瘤发生中起促癌或抑癌基因功能［12］。有研究指出，miRNAs 基因谱在子宫内膜癌组织中出现异常［13］。miR-9 是近年来被发现在多种恶性肿瘤组织中表达异常的miRNA［7］，且在不同类型的恶性肿瘤中既可以扮演癌基因的作用而促进肿瘤发生及血管生成［14］，又可以作为抑癌基因参与肿瘤细胞增殖和运动［15］。本研究中，miR-9 在子宫内膜癌组织中相对表达量显著降低，提示可能发挥抑癌基因参与了子宫内膜癌发生。本研究中，相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级G1～G2 期、浸润深度＜1/2 肌层、未淋巴结转移，miR-9 相对表达量在Ⅲ-Ⅳ期、G3 期、≥1/2 肌层、淋巴结转移显著降低，说明随着子宫内膜癌恶性程度增加，miR-9 表达量降低，提示miR-9 低表达可能参与了子宫内膜癌恶性化过程。

有研究指出，miR-9 低表达与结直肠癌病人不良预后相关，是影响病人预后的因素［16］。亦有研究指出，miR-9 是膀胱癌切除术后病人预后的影响因素［17］。本研究结果表明，低表达组生存时间和累积生存率均低于高表达组，说明提示miR-9 表达水平与病人预后有关。本研究结果进一步表明，miR-9低表达是病人预后的风险因素，可能是病人预后评估的潜在标志物。

综上所述，miR-9 在子宫内膜癌组织中低表达，且是病人预后的风险指标，但其作用的分子机制尚需开展研究明确。