白芍总苷对胶原性关节炎大鼠血糖和葡萄糖转运体的影响

袁君，王晓娟，王春，黄庆，周淑萍，徐礼五

作者单位：1安徽理工大学第一附属医院药学部，安徽 淮南 232000；

2安徽医科大学临床药理研究所，安徽 合肥 230000

类风湿关节炎（RA）是一种病因未明，以滑膜炎症为主要特点的自身免疫性疾病。RA 除了侵犯关节滑膜导致关节侵蚀破坏外，随着病程的延长，还会出现风湿心脏病、代谢综合征等多种并发症，严重影响病人的生活质量［1］。研究发现RA 病人多伴有血糖代谢异常和胰岛素抵抗等现象［2］。血糖代谢异常作为独立诱因，不仅刺激免疫细胞异常活化，加重免疫系统紊乱，同时还能直接损伤机体多个靶器官，与炎症反应等因素共同诱导并发症的发生［2-3］。因此维持糖代谢稳定对于延缓RA 疾病进程具有积极的意义。

白芍总苷（total glucosides of paeonia ，TGP）是从白芍根部提取的有效成分，临床上主要用于治疗RA 等自身免疫性疾病［4］。TGP 具有抗炎免疫调节活性，能有效改善RA 病人的关节功能，降低血沉、类风湿因子、C-反应蛋白等多种实验室指标［4］。TGP抗炎免疫调节作用主要机制包括抑制免疫细胞过度活化，调控炎症细胞因子网络平衡，恢复炎症相关的G 蛋白偶联受体信号通路至生理水平［5］。近年来有研究发现［6］TGP 主要活性成分芍药苷对糖尿病大鼠具有保护作用，可降低大鼠空腹血糖，改善胰岛素抵抗现象。临床研究也发现TGP 联合硫酸羟氯喹治疗RA 合并糖尿病病人能有效降低血糖、血脂水平［7］。

本研究于2021 年1—5 月通过考察TGP 治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠血糖、血清胰岛素、糖化血红蛋白、肝糖原和肌糖原等水平的影响，初步探讨TGP 对CIA 大鼠血糖和葡萄糖转运体的影响，为TGP 用于治疗RA 合并糖代谢紊乱提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 TGP（宁波立华制药有限公司，批号H20055058），规格0.3 克/粒，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶解；甲氨蝶呤（methotrexate ，MTX）（上海信谊药厂有限公司，批号H31020644），规格0.25克/片；卡介苗（BCG）及鸡Ⅱ型胶原（CCⅡ）为美国Sigma 公司；GLUT4 抗体（批次ab33780）；GLUT2抗体（批次ab85715）；胰岛素检测试剂盒（南京建成生物有限公司，批次20180706，规格48T）；糖化血红蛋白检测试剂盒（南京建成生物有限公司，批次20180524，规格48T）。

1.2 实验动物 Wistar 大鼠，雄性，体质量（180±20）g；购于北京维通利华有限公司，许可证SCXK（京）2016-0006。在恒温（24±2）℃、光照周期12 h∶12 h环境中饲养1周后实验。

1.3 实验方法

1.3.1 CIA大鼠模型制备与评价 将BCG放置于水浴锅中80 ℃水浴1 h 后，与无菌液体石蜡充分研磨呈乳白状，配制成浓度是4 g/L的弗氏完全佐剂。将CCⅡ溶解在0.1 mol/L 乙酸中，并用等体积的弗氏完全佐剂乳化，使其终浓度为2 g/L，然后在4 ℃下孵育过夜。实验造模大鼠60只，在大鼠的右后足跖和尾根部进行皮下注射各0.1 mL 混合溶液，以诱导CIA模型，正常组的大鼠用同样方法注射溶媒，记为第0天（D0）并在D7 在尾根部再次进行加强注射。致炎后D14 测量大鼠的足爪容积和空腹血糖，选取关节明显肿胀且血糖浓度较高的大鼠18只，重新采用随机数字表法分组（每组6 只）进行后续给药，TGP 组大鼠每天按照50 mg/kg，MTX 组每3 天按照0.5 mg/kg，模型组大鼠给予等量的溶媒。各给药组在大鼠致炎后D14至D30连续灌胃给药。

1.3.2 血糖水平 初次免疫前，及免疫后D14 和D30，大鼠空腹眼内静脉层取血0.4 mL，采用罗氏血糖仪（ACCU-CHEK，上海罗氏诊断产品有限公司）监测血糖水平。

1.3.3 血清胰岛素和糖化血红蛋白水平 末次给药后24 h，大鼠空腹眼内静脉层取血0.4 mL，于室温下静置1 h，3 000 r/min 离心10 min 分离出血清，分别采用糖化血红蛋白试剂盒和胰岛素试剂盒对各组大鼠血清胰岛素和糖化血红蛋白水平进行检测，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3.4 肝糖原和肌糖原水平 末次给药后24 h，处死实验动物，解剖并分离出肝脏及后腿肌肉样本。生物样本中糖原含量水平采用试剂盒检测（南京建成生物工程研究所）。参照说明书将组织样本用生理盐水进行漂洗，然后用滤纸吸干多余的水分。各样本准确称取100 mg，与碱液混合后，沸水中煮20 min 后冷却。将稀释制备的肝糖原检测液和肌糖原检测液与样本进行混合，在620 nm 处比色定量测定。

1.3.5 葡萄糖转运体水平 末次给药后24 h，处死动物，解剖并分离出肝脏及后腿肌肉样本。剪碎组织后加入裂解液进行匀浆，冰上研磨30 min，采用蛋白定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司）对组织蛋白进行定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，以5%牛血清白蛋白对膜进行封闭2 h。加葡萄糖转运体-2（GLUT2）和葡萄糖转运体-4（GLUT4）的一抗抗体（英国Abcam 公司），4 ℃孵育过夜；洗涤后加二抗（上海碧云天生物技术有限公司），37 ℃孵育1 h；显影液显影，条带灰度值采用Image-J软件进行分析处理。以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的比值表示相对蛋白表达量。

1.3.6 关节组织病理学 末次给药后24 h，股动脉放血处死各组大鼠，浸泡于0.1%新洁儿灭溶液中10 min，用4%甲醛溶液固定取下大鼠的继发侧踝关节，常规方法石蜡包埋、切片和HE 染色，采用光学显微镜观察各组大鼠继发侧踝关节病理，从滑膜增生、炎性细胞浸润、软骨侵蚀和血管翳形成等方面进行定量评价［8］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计软件对数据进行分析，计量资料以±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGP 对CIA 大鼠足爪肿胀的影响 由表1 可知，大鼠致炎后D14足爪明显肿胀，约在致炎后D26肿胀达到峰值，随后肿胀逐渐自行缓解。与模型组大鼠相比，TGP 和MTX 治疗给药能够明显抑制大鼠非致炎侧足爪肿胀。

表1 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠非致炎侧足爪肿胀的影响/（mL，±s）

表1 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠非致炎侧足爪肿胀的影响/（mL，±s）

注：①与正常组相比较，P＜0.01。②与模型组相比较，P＜0.01。

组别正常组模型组TGP组MTX组F值P值第30天1.36±0.04 1.88±0.05①1.75±0.08②1.61±0.07②87.72＜0.001鼠数6666第0天1.33±0.04 1.33±0.05 1.32±0.04 1.34±0.05 0.04 0.990第14天1.34±0.05 1.51±0.02①1.55±0.04 1.57±0.03 30.67＜0.001第18天1.37±0.04 1.71±0.03①1.66±0.04 1.59±0.05②55.26＜0.001第22天1.38±0.04 1.96±0.10①1.81±0.05②1.74±0.05②48.96＜0.001第26天1.33±0.05 1.99±0.06①1.86±0.02②1.76±0.12②48.06＜0.001

2.2 TGP 对CIA 大鼠踝关节组织病理学的影响大鼠关节组织病理学结果如图1所示。正常组大鼠关节面光滑完整，关节间隙均匀，软骨外侧可见少量排列整齐的滑膜细胞。模型组大鼠关节间隙不均一，关节面中可见增生为多层、排列紊乱的滑膜细胞，并伴有大量炎性细胞浸润，明显的软骨侵蚀及局部炎症。与模型组相比较，TGP 和MTX 治疗给药能够显著抑制滑膜层滑膜细胞增生，减少炎性细胞浸润，同时在一定程度上能够改善软骨侵蚀。模型组，TGP 和MTX 组大鼠的关节组织病理学评分依次（12.5±1.2）、（7.5±0.8）、（6.3±0.8）。与模型组大鼠相比，TGP 和MTX 治疗给药能显著降低大鼠踝关节组织病理学评分（F=36.69，P＜0.001）。

2.3 TGP 治疗给药对CIA 大鼠血糖的调控作用结果如表2 所示，致炎前各组大鼠空腹血糖浓度差异无显著性；致炎后D14，模型组大鼠空腹血糖浓度明显高于正常组大鼠。与模型组大鼠相比，TGP 治疗给药能够显著降低大鼠的血糖浓度，差异有统计学意义。

表2 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠血糖浓度的影响/（mmol/L，±s）

表2 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠血糖浓度的影响/（mmol/L，±s）

注：①与正常组相比较，P＜0.01。②与模型组相比较，P＜0.01。

组别正常组模型组TGP组F值P值第30天6.66±0.32 12.92±1.98①9.97±1.13②20.54＜0.001鼠数666第0天6.52±0.48 6.70±0.33 6.82±0.45 0.45 0.648第14天6.71±0.34 9.20±0.60①9.12±0.52 30.78＜0.001

2.4 TGP 治疗给药对CIA 大鼠胰岛素、糖化血红蛋白的影响 结果如表3所示，与正常组相比较，模型组大鼠空腹胰岛素水平和糖化血红蛋白水平明显升高，差异有统计学意义；与模型组大鼠相比较，TGP治疗给药能够显著降低胰岛素水平和糖化血红蛋白水平，差异有统计学意义。

2.5 TGP 治疗给药对大鼠肌糖原和肝糖原的影响 结果如表3所示，与正常组相比较，模型组大鼠的肝糖原和肌糖原含量水平均明显降低，差异有统计学意义；与模型组大鼠相比较，TGP治疗给药能够显著提高大鼠肝脏和肌肉糖原水平，差异有统计学意义。

表3 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠胰岛素、糖化血红蛋白、肌糖原、肝糖原的影响/±s

表3 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠胰岛素、糖化血红蛋白、肌糖原、肝糖原的影响/±s

注：①与正常组相比较，P＜0.01。②与模型组相比较，P＜0.01。

组别正常组鼠数666空腹胰岛素/（µg/L）13.9±1.42糖化血红蛋白/%0.50±0.05肌糖原/（mg/g）8.70±0.67肝糖原/（mg/g）45.85±5.63模型组TGP组F值P值17.48±1.32①33.83±4.23②45.07＜0.001 24.6±2.22①16.7±1.87②34.17＜0.001 0.78±0.06①0.63±0.07②27.32＜0.001 2.30±0.53①5.35±0.82②65.73＜0.001

2.6 TGP 治疗给药对CIA 大鼠GLUT-2 和GLUT-4 水平的影响 结果如图2 所示，正常组，模型组和TGP 组大鼠的GLUT-2/β-actin 比值依次为（0.76±0.07）、（0.29±0.06）、（0.77±0.09）。与正常组相比较，模型组大鼠肝脏组织GLUT-2 表达水平显著低于正常对照组；与模型组相比较，TGP 给药组GLUT-2 表达水平显著升高，差异有统计学意义（F=51.24，P＜0.001）。此外，正常组，模型组和TGP 组大鼠的GLUT-4/β-actin 比值依次为（0.89±0.05）、（0.36±0.03）、（0.81±0.04）。与正常组相比，模型组大鼠肌肉组织GLUT-4 表达水平显著低于正常对照组；与模型组相比较，TGP治疗组大鼠肌肉组织GLUT-4表达水平显著升高，差异有统计学意义（F=177.21，P＜0.001）。

图2 白芍总苷（TGP）治疗给药对胶原性关节炎（CIA）大鼠GLUT-2和GLUT-4水平的影响

3 讨论

RA 是一类以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性、慢性自身免疫病。在RA 疾病进程过程中会诱发多种并发症，其中血糖异常升高在长病程RA 病人中较为常见。研究发现RA 病人合并糖尿病发生的概率约为20%［9］，远远高于正常人群。目前对RA病人血糖异常升高的原因尚未完全阐明清楚，但一般认为在RA 发病初期，炎症免疫反应及其调控因素参与诱发了血糖的代谢异常［10］。然而血糖的异常升高可反过来促进炎症和免疫反应。这两种因素在RA 疾病发展过程中，相互作用构成恶性循环［11］，加重RA 病情及诱发多种并发症，严重影响病人的预后。因此，在RA 病人早期诊断和治疗过程中，及时监控血糖代谢情况以及维持血糖的稳定对于控制疾病的发展具有积极的意义。

TGP是我国传统中药白芍根中的提取有效活性成分成，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎免疫调节活性等多种药理活性［12］。TGP 治疗RA 疗效肯定，安全性高，能明显改善病人的关节功能，降低实验室指标血沉、C 反应蛋白及类风湿因子等［13］。TGP 联合来氟米特等改变病情抗风湿病药物（DEMARDs）治疗RA 不仅疗效协同增加，同时还能降低DEMARDs 引起的肝肾损伤等不良反应［14］。研究报道TGP 主要活性成分芍药苷对2型糖尿病动物模型具有良好治疗作用，不仅可以抑制糖尿病动物机体炎症反应，还可以降低空腹血糖，改善胰岛素抵抗水平，提示TGP具有维持血糖代谢稳态等作用。本研究初步考察TGP 对关节炎动物模型血糖的调控作用。大鼠CIA 模型是兼有体液免疫和细胞免疫的慢性炎症性动物模型，其遗传背景和病理学改变与RA 极为相似，是研究RA 发病机制、病程变化和药物作用的最常用模型之一［15］。本研究中，我们首先建立了大鼠CIA 模型，结果表明模型大鼠足爪肿胀在致炎后D26 达到高峰期，随后逐步缓解。组织病理学结果表明模型大鼠关节间隙不均一，关节面可见异常的滑膜细胞增生并伴有炎性细胞浸润和软骨侵蚀，而TGP 和阳性对照药MTX 能显著抑制足爪肿胀，改善关节组织病理学，提示当前模型建立成功。为了探讨TGP 对CIA 大鼠血糖的作用，在实验开始之前对每只大鼠进行标记，并且在大鼠致炎前，致炎后（给药前）及给药后三个不同的时间点检测大鼠空腹血糖水平。研究结果表明致炎前三组大鼠之间血糖差异无统计学意义，致炎后D14，模型组大鼠血糖浓度明显高于正常组，且TGP 治疗给药能显著降低大鼠空腹血糖水平和糖化血红蛋白水平。此外，本研究还发现TGP 治疗给药能够降低模型大鼠胰岛素水平，提示对胰岛素抵抗具有改善作用。

正常机体血糖浓度维持在一个相对恒定的水平，主要是受到神经系统、激素及组织器官共同调节的结果。在生理性血糖升高情况下，肝脏作为血糖浓度最主要器官，会通过快速上调GLUT-2，加速摄取过多的葡萄糖进入肝细胞，通过肝糖原合成来降低血糖浓度［16］。除肝脏之外，肌肉组织细胞膜上GLUT4 水平也会上调，加快对血液中葡萄糖吸收，合成肌糖原或转变成脂肪储存起来。当血糖浓度偏低时，肝脏通过糖原分解及糖异生升高血糖浓度［17］。本研究结果表明TGP 给药后能够增加关节炎大鼠肝脏和肌肉糖原的含量水平，进一步研究发现TGP 上调了GLUT-2 和GLUT-4 的水平，提示TGP通过调控转运体，加快机体组织对葡萄糖吸收，达到稳定血糖水平作用。TGP 如何调控GLUT-2 和GLUT-4，已有研究发现GLUT4 受到胰岛素受体介导的信号通路正性调控［18］。芍药苷作为TGP 最主要活性成分能够调控糖尿病下异常的胰岛素受体信号通路［19］，提示TGP 调控GLUT 可能与胰岛素受体信号通路有关，而该作用机制可能独立于其抗炎免疫调节作用。

综上所述，TGP 能够维持CIA 大鼠血糖稳定，该作用可能与其调控GLUT-2和GLUT-4水平有关。

（本文图1见插图8-1）