RNA 干扰β-catenin 基因对大肠癌细胞SW480的生长抑制及基因表达

李鑫鑫 李安庆 赵卫东 纪红梅 王峰

(滨州医学院附属临淄区人民医院消化内科，山东 淄博 255400)

RNA干扰(RNAi)是小片段双链RNA分子(siRNA)介导的生物细胞内同源基因的特异性转录后基因沉默现象。是研究基因功能的一种重要技术，目前已广泛用于基因组的研究及肿瘤的治疗研究。研究认为，Wnt/β-catenin 信号通路在大肠癌的发生发展中起重要作用。90%以上的大肠癌存在 Wnt/β-catenin 信号通路的激活以及β-catenin 在细胞内的积聚。调节β-catenin 在胞内的稳定及积累是Wnt 信号通路中最关键的事件之一。本试验通过 RNA干扰技术，诱导β-catenin 基因沉默，探讨 RNA干扰技术对大肠癌治疗的价值。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验细胞 大肠腺癌细胞株 SW480由四川大学华西医院消化外科与器官微循环试验室提供。

1.1.2主要试剂 转染试剂lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen公司)；RPMI1640培养基、新鲜胎牛血清(Gibco公司)；siRNA双链体 (上海吉玛制药技术有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI，Sigma公司)；引物合成及探针修饰(上海生工生物工程公司)；Taq DNA聚合酶、聚合酶链反应(PCR)缓冲液(10X)、MarkerDL2000 (TaKaRa公司)；琼脂糖 (Bio west公司)。

1.1.3主要仪器 Class II A/B3超净工作台、恒温二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)；高速离心机(德国Heraeus公司)；实时荧光定量基因扩增仪 iCycler iQ、Model 550酶免疫检测仪(美国Bio-Rad)。

1.2试验方法 siRNA的设计与合成根据 siRNA 设计原则设计并合成β-catenin基因编码区的3个siRNA序列，如下:siRNA片段1正义链5′-GGAUGUGGAUACCUCCCAATT-3′，反义链5′-UUGGGAGGUAUCCACAUCCTT-3′;siRNA片段2正义链5′-CCCACUAAUGUCCAGCGUUTT-3′，反义链5′-AAC-GCUGGACAUUAGUGGGTT-3′；siRNA片段3正义链5′-GCUGGUGGAAUGCAAGCUUTT-3′，反义链5′-A-AGCUUGCAUUCCACCAGCTT-3′；无意义链正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。siRNA 模板合成后，根据体外转录试剂盒进行操作。

1.2.1细胞复苏及传代 SW480细胞株解冻后，加入预热的RPMI1640 培养基，离心，移去上清液，再加入新鲜的RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、20 mmol/L碳酸氢钠、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)，37℃ CO2培养箱培养。待细胞融合生长至80%培养瓶底面时，用0.25%胰蛋白酶溶液制成悬液，混合均匀后，按1∶2～1∶3比例转移至新培养瓶中，每2～3 d传代1次，试验所用细胞处于对数生长期。

1.2.2siRNA 双链体转染 siRNA 转染前24 h，用胰蛋白酶消化回收细胞，以1∶10的比例用不含抗生素的RPMI1640培养基稀释细胞，向六孔板的每孔中加入2 ml的细胞悬液，每孔中大约有3×105个细胞。细胞接种24 h后进行转染，确保转染时细胞密度为50%～80%。在一个EP管(A管)中加入4 μl 20 μmol/L的siRNA双链体和296 μl的RPMI1640培养基混匀，在另一个EP管(B管)中，向292 μl的RPMI1640培养基中加入8 μl脂质体Lipofectamine2000,将A管溶液缓慢加入B管溶液中，轻混，于室温孵育20～25 min形成脂质体复合物。将脂质体复合物按每孔600 μl加入SW480细胞中，并设阴性对照和空白对照。通过轻轻敲击培养板30 s以使之混匀，将细胞培养板于37℃ 5%CO2的培养箱中孵育4～6 h后观察不同时间点的作用。

1.2.3RT-PCR

1.2.3.1引物和探针设计 β-catenin 正义链5′-CCTGCCATCTGTGCTCTTC-3′，反义链5′-GACAAA-GGGCAAGATTTCGA-3′，β-catenin探针5′-FAM-TGACCAGCCGACACCAAGAAGCA-ECLIPSE-3′β-actin正义链5′-AAGGCCAACCGCGAGAA-3′，反义链5′-CCTCGTAGATGGGCACA-3′，β-actin探针5′-FA-MTCAACACCCCAGCCATGTACGTTAMRA-3′。用FAM荧光作报告基团标记探针5′端，用 TAMRA 荧光淬灭基团标记 3′端。

1.2.3.2RT-PCR检测细胞β-catenin mRNA表达 取6孔板5个，每孔接种3×105个细胞培养，每孔加入2 ml培养基，细胞培养24 h贴壁后转染，分组为 siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、阴性对照组、空白对照组,每组设置复孔6个。其中siRNA组转染细胞时加入合成的β-catenin siRNA , 阴性对照组转染细胞时加入合成的阴性对照 siRNA。转染后继续培养48 h。Trizol reagent 提取细胞总 RNA，参照说明书逆转录后PCR扩增，参照 GENE BANK 序列设计引物。设 GAPDH 为内参，并设相应的阴性对照和空白对照，PCR条件：94℃ 2 min 1个循环，94℃ 20 s，54℃ 20 s，70℃ 30 s 80℃ 20 s，共 40 个循环。增益率为 1.5。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4MTT比色法 以5×103个/孔的细胞浓度接种细胞于96孔板，每孔加入200 μl培养基，每组设6个复孔，置于37℃CO2孵箱中培养24 h后转染，实验终止前4 h加 MTT 20 μl/孔，继续 37℃孵育，最后吸去孔内液体，加入 DMSO 150 μl/孔，震荡10 min。选择 490 nm 波长，测定各孔光吸收值。计算每组细胞增殖抑制率，并在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。增殖抑制率=(1-siRNA组光吸收值/对照组光吸收值)×100%

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 细胞的接种与收集：取6孔板5个，每孔接种3×105个/ml细胞培养，每孔加2 ml培养基，贴壁24 h后转染，转染48 h后用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，约1×106个/ml,细胞悬液离心，弃上清液，加1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)到离心管中，用1 ml枪头吹打均匀后移入1 ml EP管，再次离心后弃上清液，加1 ml -20℃预冷的冰乙醇(70%乙醇)到小EP管中，蜗旋振荡器上震荡细胞至分散，置于4℃冰箱冷藏过夜。离心后将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4℃放置20～30 min，测定前将样品用300目尼龙膜过滤，将样品加入FCM样品室，以激发波长488 nm测定。

1.3统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1RT-PCR检测 siRNA1、siRNA2、siRNA3组β-catenin mRNA表达均明显低于阴性对照组及空白对照组(P<0.01)。siRNA1组、siRNA3组β-catenin mRNA表达明显低于siRNA2组(P<0.01)，说明siRNA1组、siRNA3组干扰抑制作用优于siRNA2组，前两组对靶基因的干扰特异性优于后者。siRNA1组和siRNA3组β-catenin mRNA表达无显著差异(P>0.05)。阴性对照组(无意义链)和空白对照组β-catenin mRNA表达无显著差异(P>0.05)，证明非特异链不产生干扰效果。 见表1。

2.2流式细胞仪检测SW480细胞的凋亡率 siRNA转染后48 h，siRNA1、siRNA2、siRNA3组细胞凋亡率明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)。siRNA1组、siRNA3组细胞凋亡率明显高于siRNA2组(P<0.05)。说明siRNA组、siRNA3组干扰抑制作用比siRNA2组更强，siRNA1组、siRNA3组对靶基因的特异性优于siRNA2组。而阴性对照组和空白对照组的凋亡率无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.3MMT比色法 siRNA1、siRNA2、siRNA3组增殖抑制率明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)。转染后48 h及72 h siRNA1组、siRNA3组增殖抑制率明显高于siRNA2组(P<0.05)。说明siRNA1组、siRNA3组对靶基因的干扰特异性优于siRNA2组。siRNA1组和siRNA3组增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。阴性对照组和空白对照组增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。各siRNA组增殖抑制率均有时间依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞增殖抑制率比较

3 讨 论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，其发病率位于消化道肿瘤的第 3 位。具有恶性程度高、浸润性生长、易发生远处转移及易复发等生物学特点〔1，2〕。尽管诊疗技术的提高使结肠癌患者的预后有所改善，但晚期结肠癌患者的 5 年生存率仍然较低〔3〕。研究显示多种人类肿瘤细胞中存在miRNA的异常表达，表明miRNA 的异常表达参与了肿瘤的发生发展〔4～8〕。不同的 miRNA 通过发挥癌基因和抑癌基因的作用参与细胞增殖、凋亡和侵袭转移的调控，进而影响肿瘤的发生、发展过程〔9，10〕。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路广泛参与生物体内细胞信息调控，在细胞增殖、组织修复及多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔11〕。β-catenin作为多种miRNA的调控靶基因，能够通过进一步调控下游靶基因，对一系列生物学事件(如细胞增殖、凋亡、侵袭转移等)进行干预，最终影响多种肿瘤的发生发展〔12〕。研究表明，β-catenin在诸如肝癌〔11〕、胃癌〔13，14〕、结肠癌〔15〕中高表达，证实，Wnt/β-catenin信号通路在大肠癌的发生发展过程中起重要作用〔15〕。Wnt通路被激活时，β-catenin进入细胞核，与转录基因结合，启动靶基因的表达，激活靶基因的致癌作用〔16〕。RNA干扰技术已成为一个很好的反向遗传学研究工具，被广泛用于基因功能的研究〔17～19〕和基因治疗方式的研发〔20，21〕。其原理是双链RNA(dsRNA)在细胞质内被一种称为Dicer的酶特异识别并剪切成长度为20～23 bp的siRNA；然后siRNA被组装到RNA诱导沉默复合体(RISC)中。RISC被激活后，siRNA双链被解链成正义链与反义链，反之siRNA链按照碱基互补的原则与靶标mRNA完全互补结合，引导RISC对mRNA进行切割。mRNA被切割后降解，基因表达因此受到抑制〔17～19〕。

本研究证实靶向β-catenin 的 RNAi 可以有效诱导β-catenin 基因沉默， 有效抑制β-catenin蛋白的表达；针对β-catenin 的靶向 siRNA 可有效抑制大肠腺癌 SW480 细胞增殖，说明针对β-catenin 的 RNA 干扰对结肠癌 SW480 细胞的生长具有抑制作用。本研究结果考虑作用机制如下： 经典 Wnt/β-catenin 信号通路的 Wnt配体与 卷 曲 蛋 白(FZD)受体及共同受体相关蛋白(LRP)5/6 结合，启动 Wnt 信号通路，DVL蛋白磷酸化后，将信号传导入细胞内，抑制多发性腺瘤病大肠杆菌(APC)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、轴蛋白(AXIN)、β-catenin复合体酶活性，进而β-catenin蛋白不被磷酸化，防止泛素蛋白酶对其识别降解。在 Wnt 信号缺失情况下，β-catenin能被磷酸化后的多蛋白复合体降解。该多蛋白复合体失活情况下，β-catenin将在细胞质内大量蓄积，达到一定浓度时进入细胞核内与T细胞因子(TCF)结合，激活 TCF 转录，进而导致下游靶基因进一步转录〔22〕。RNAi技术可通过诱导β-catenin基因沉默并阻止β-catenin激活Wnt信号通路，从而抑制结肠肿瘤的生长。 β-catenin 的表达与大肠癌生长、转移密切相关，并可作为判断预后的指标〔16〕。阻断β-catenin 表达可达到抑制肿瘤生长及转移的目的〔16〕。如何有效抑制β-catenin 的表达是肿瘤治疗的关键所在。RNA 干扰为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径，提供了新思路。