生熟三七醇提物对脑缺血再灌注损伤小鼠的疗效

朱蔚然 王洁 瞿领航 涂济源 傅敏 王光忠，2 曹国胜，2

(1湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065；2湖北省中药炮制工程技术研究中心)

目前脑卒中是危害人类生命安全和身体健康的重大疾病之一〔1〕，在老年人群体中发病率较高，并随着我国老龄化的加速，发病率呈上升趋势，其中缺血性脑卒中占比较大〔2，3〕。三七有活血散瘀、消肿定痛功效，是防治心脑血管相关疾病的常用中药材〔4，5〕，研究表明，三七有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗感染、改善缺血性脑组织损伤等作用〔6〕。在临床上，三七可生熟两用，但功效却有显著差异，《中药大辞典》中三七生品活血化瘀、消肿止痛；经过炮制后，熟三七有补气补血、健体的功效〔7〕。三七在经过炮制后主要药效发生改变，可能与炮制前后三七主要药理活性成分的变化有一定的关系。本研究旨在探讨生熟三七醇提物对脑缺血再灌注损伤小鼠的疗效。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1药物 生三七粉的制备：40头三七，洗净，干燥，粉碎后过四号筛。熟三七粉的制备：40头三七，加水浸泡3 h，在60℃，75%RH的条件下加30%的水润制24 h，110℃蒸制3 h，切成约1 mm厚度的薄片，80℃干燥12 h，粉碎后过四号筛〔8〕。生熟三七醇提物的制备：称取适量生熟三七药粉，加10倍量的70%乙醇，水浴加热，回流提取3次，每次2 h，过滤提取液，合并滤液，挥干乙醇，冷冻干燥成药粉，贮存备用。

1.1.2动物 120只雄性C57BL/6小鼠，体重22～24 g，动物许可证号为SCXK(鄂)2017-0012，在实验室环境中适应性喂养，3 d后进行实验。

1.1.3试剂 三七皂苷R1对照品(批号：1114-0025，含量≥98.0%)、人参皂苷Rg1对照品(批号：0148-0025，含量≥98.5%)及人参皂苷Rb1对照品(批号：0149-0025，含量≥98.5%)均购自成都普思生物科技股份有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC，批号C10103901)购自上海麦克林生化科技有限公司；丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；无水乙醇和水合氯醛为AR级别，均购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.1.4仪器 Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪购自安捷伦科技(中国)有限公司；1730R高速冷冻离心机购自韩国Gene公司；Box998型酶标仪购自美国BioTek仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1含量测定

1.2.1.1高效液相色谱法(HPLC)色谱条件 色谱柱：Agilent5HC-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱温：20℃；检测波长：203 nm；进样体积：10 μl；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水；梯度洗脱〔9〕：0～12 min，19%流动相A；12～60 min，19%→36%流动相A。

1.2.1.2溶液配制 混合对照品溶液：分别精密称取10 mg三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品置于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度。分别精密量取1 ml以上各对照品溶液置于同一10 ml容量瓶中，再加入甲醇稀释至刻度。供试品溶液：分别精密称取0.6 g生熟三七粉末，置于100 ml锥形瓶中，精密加入50 ml 70%甲醇溶液，称重，于室温下超声45 min，放冷，再称重，用70%甲醇溶液补重，摇匀，静置，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。使用高效液相色谱仪检测三七中皂苷类成分含量。

1.2.2分组、给药和动物模型的制备 对C57BL/6小鼠进行随机分组：假手术组，模型组，生三七醇提物低剂量组(生低组，200 mg/kg)，生三七醇提物高剂量组(生高组，400 mg/kg)，熟三七醇提物低剂量组(熟低组，200 mg/kg)，熟三七醇提物高剂量组(熟高组，400 mg/kg)，分组后给药组分别灌胃相应剂量药物，假手术组与模型组灌胃等量生理盐水，每天灌胃1次，连续3 d。小鼠造模前禁食不禁水12 h，采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤模型〔10〕，假手术组同模型组方法进行处理，但不插入线栓。

1.2.3神经功能评分 小鼠造模24 h后，参照Longa评分法〔11〕对各组神经功能进行评分。将小鼠放置平台上，行动正常，神经功能无损伤：0分；右前肢不能完全伸展：1分；将小鼠放置平台上，行走时会向右侧(瘫痪侧)转圈：2分；将小鼠放置平台上，行走时会向右侧(瘫痪侧)倾倒：3分；将小鼠放置平台上，不能自发行走，存在丧失意识现象：4分。

1.2.4TTC染色法测定脑梗死体积 小鼠造模24 h后，将小鼠处死后迅速取脑，于-20℃冰箱中冷冻20 min，切取脑片，切成5片，厚度为2 mm左右。将切片放置于培养皿中，倒入1%的TTC染液，避光的条件下37℃孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定，24 h后取出染色后的脑片，排列，标号，拍照并记录，利用ImageJ图像处理软件计算脑梗死体积。

1.2.5脑组织中MDA和MPO含量检测 小鼠造模24 h后，将小鼠处死后迅速取脑，-20℃冰箱中冷冻20 min，分离出缺血侧大脑，制备脑组织匀浆，4 000 r/min离心10 min，吸取上清并放入-20℃冰箱，按各试剂盒说明书来检测各生化指标。

1.2.6脑组织苏木素-伊红(HE)染色 小鼠造模24 h后，将小鼠处死后迅速取脑，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脱水，石蜡包埋，5 μm切片，脱蜡至水，HE染色，脱水，中性树脂封固，于显微镜下观察结果。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1三七炮制前后活性成分变化 生三七中三七皂苷R1含量为1.1%，人参皂苷Rg1含量为5.1%，人参皂苷Rb1含量为5.7%，而熟三七中三七皂苷R1含量为0.6%，人参皂苷Rg1含量为3.5%，人参皂苷Rb1含量为2.8%。表明三七在炮制过后，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量显著降低。见图1。

图1 对照品及生熟三七样品HPLC图谱

2.2生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠神经功能评分的影响 与假手术组相比，模型组神经功能评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，生低组、生高组、熟高组神经功能评分均显著降低(均P<0.05)。见表1。

2.3生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠脑组织MDA和MPO含量的影响 与假手术组相比，模型组损伤小鼠脑组织MDA和MPO含量显著升高(P<0.05)；相较于模型组，生低组、生高组、熟低组、熟高组脑组织MDA含量均显著下降(P<0.05)，生高组MPO含量显著下降(P<0.05)。见表2。

表1 生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠神经功能评分及脑梗死体积的影响

表2 生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠MDA和MPO含量的影响

2.4生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠脑梗死体积的影响 与假手术组相比，模型组脑梗死体积显著增大(P<0.05)；与模型组相比，生低组、生高组、熟低组、熟高组脑梗死体积显著减小(P<0.05)。见表1、图2。

2.5生熟三七醇提物对脑I/R损伤小鼠脑组织形态的影响 假手术组脑组织结构紧密，细胞形态正常，神经元排列整齐；模型组脑组织结构较为疏松，细胞间隙增大，大量细胞凋亡；在给药干预后，生低组、生高组、熟低组、熟高组脑组织损伤形态均有所改善，其中生高组改善作用最明显。见图3。

图2 各组脑梗死TCC染色

图3 各组脑组织HE染色(×200)

3 讨 论

缺血性脑卒中是指由于脑血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织受损的一类疾病〔12〕，若能及时溶栓治疗，恢复脑部血流供应，可减轻神经功能损伤，而在脑缺血一定时间后血流恢复，脑组织损伤不仅不会减轻，反而会进一步加重，称为脑缺血再灌注损伤〔13，14〕。缺血性脑卒中的病理机制十分复杂，会引发自由基损伤，炎症反应，神经细胞凋亡等级联反应〔15，16〕。临床上三七已经广泛应用于防治缺血性脑卒中，研究表明，三七中皂苷类成分对脑血管相关疾病有保护作用〔17〕。

三七中主要药理活性成分包括三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Rb1、Re等多种皂苷类成分〔18，19〕。生三七蒸制为熟三七后，通过高效液相色谱法测定含量，发现三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量均有所下降，原因是在蒸制过程中，高温使得三七中皂苷类成分的糖苷键发生裂解，脱掉部分糖基，会转化成含糖基较少的皂苷〔20〕。

神经功能损伤评分及脑梗死体积可反映脑缺血再灌注损伤的程度。脂质过氧化终产物，其含量高低可反映出脑细胞氧化应激损伤的程度〔21〕；在脑缺血再灌注发生后，MPO会催化反应生成大量氧化剂，导致氧化性脑组织损伤〔22〕。

本研究结果表明，生三七抗缺血性脑损伤的作用优于熟三七，可能与三七在炮制后其主要活性成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量的减少有关，不过这一假设需后续研究验证。