TFF1在食管癌中表达及其基因调控网络

李亚光 邓同兴 宋德志 李晓龙

(1漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462000；2广西医科大学基础医学院)

食管癌(ESCA)是全球第七大常见癌症，死亡率居第六位〔1〕。ESCA可分为食管鳞癌(ESCC)和腺癌(EAC)〔2〕。ESCC在亚洲较为常见，占ESCA 90%以上，EAC发生在欧美国家〔3〕。中国是ESCA的高发国家，主要是ESCC。此外，ESCC在中国大陆的癌症发病率排名第五，死亡率排名第四〔4〕。ESCA作为恶性肿瘤的主要组织病理学表现形式，是一种低生存率的致命性恶性肿瘤〔5〕。尽管有先进的诊断和治疗方法，但大多数病例诊断为晚期，由于转移迅速，预后较差〔6〕。各种研究报道，超过50%的患者在早期诊断时就开始转移。根据转移的分期，恶性肿瘤可分为局部转移和远处转移。此外，已确定远处转移阶段可导致约50%的恶性肿瘤患者死亡〔7〕。ESCA 5年总生存率低于15%〔4，8〕。ESCA患者由于诊断晚、治疗反应差导致预后差〔9，10〕。三叶因子家族(TFF)由胃多肽(pS2)/TFF1、解痉肽(SP)/TFF2、肠三叶因子(ITF)/TFF3三种分泌肽组成。TFFs在胃肠道中大量表达，保护黏膜上皮细胞免受各种损伤，促进上皮细胞〔11〕的连续性；然而，它们根据表达〔12〕组织的病理生理状态表现出不同的作用。由于TFF1在肿瘤中表达量和肿瘤发生环境不同，其在肿瘤中的作用仍存在争议。TFF1最初在乳腺癌细胞〔13〕中被发现，TFF1被认为是一种致癌基因〔14，15〕，是激素治疗阳性反应的预测因子〔16，17〕。在不同的肿瘤组织(结肠癌，胰腺和卵巢)，与正常组织相比，TFF1与刺激细胞存活、迁移、侵袭性和肿瘤扩散相关〔18～20〕。由于TFF1缺乏的小鼠会发展成抗幽门腺瘤，30%进展为胃癌〔21〕。本研究旨在探讨TFF1在ESCA中表达及其潜在的基因调控网络。

1 实验方法

1.1Oncomine数据库分析 在Oncomine4.5数据库中分析ESCA中TFF1的mRNA表达。Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的致癌基因芯片数据库和综合数据挖掘平台，包含715个基因表达数据集和来自86 733个癌症组织和正常组织〔22〕的数据。本研究从Oncomine数据库中获得TFF1在不同癌组织及其相邻正常对照样本之间的转录表达。本分析并借鉴了一系列ESCA研究，包括Kim食管癌、Kimchi食管癌、Hao 食管癌研究。并分析了TFF1在食管癌组织中相对于其在正常组织中表达情况。采用t检验比较转录表达的差异。P值的常用值和差异倍数如下：P<0.01，差异倍数：1.5，基因排列：10%，数据类型：mRNA。

1.2GEPIA数据库分析 利用GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)研究食管癌肿瘤组织与正常组织间TFF1的表达情况。GEPIA 是一种基于肿瘤基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)项目的在线mRNA表达评估工具〔23〕。在此基础上进行了箱形图和肿瘤分期图分析，当P<0.01时，认为差异有统计学意义。

1.3cBioPortal数据库分析 cBioPortal(http：//cbioportal.org)是一个开放获取的资源，用于探索、可视化和分析多维癌症基因组数据，目前包含225项癌症研究。我们用cBioPortal分析了TCGA ESCA样品中TFF1的变化。搜索参数包括突变和mRNA表达。OncoPrint选项卡显示TFF1中每个样本的遗传突变概况。并网络可视化了来自公共通路数据库的TFF1的生物相互作用网络，使用基于每个基因组改变频率的颜色编码和筛选选项。其中包括改变频率较大的邻近基因。以Kaplan-Meier图显示ESCA患者TFF1基因突变及其与OS的相关性，并进行Log-rank检验，判断生存曲线差异的意义。

1.4Linked Omics数据库分析 Linked Omics数据库(http：//www.linkes.org/ login.php)是一个基于web的平台，用于分析32个TCGA癌症相关多维数据集〔24〕。采用Linked Omics的Link Finder模块研究TCGA ESCA队列中与TFF1相关的差异表达基因，结果采用Pearson相关系数进行统计学分析。所有的结果都在火山图、热图或散点图中以图形形式呈现出来。Linked Omics的Link-Interpreter模块对差异表达的基因进行通路和网络分析。应用基于Web的Web Gestalt中的综合功能分类数据库〔25〕，对Link Finder结果中的数据进行签名和排序，使用GSEA对GO〔细胞组分(CC)、通路分析(BP)、分子功能(MF)〕、KEGG通路进行分析。

2 结 果

2.1TFF1在不同癌症中的mRNA表达情况 首先，分析TFF1在不同肿瘤组织中的mRNA表达情况。Oncomine数据库的主要功能是基因表达差异分析、基因表达与临床相关性分析及多基因共表达分析。利用Oncomine数据库检测TFF1 mRNA在不同肿瘤和正常临床标本中的表达。最终，650个数据集，包括80 551个样本被选中，与正常组织相比，TFF1的mRNA在头与中枢神经系统癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌及胰腺癌中表达显著上调，而在结直肠癌、肾癌及恶性间叶肿瘤中表达下调(图1)。提示TFF1的转录水平主要取决于肿瘤类型。

2.2TFF1在ESCA中的表达情况 从TCGA和GEO数据库中评估TFF1在多个ESCA研究中的转录水平。Oncomine4.5 分析食管癌中 TFF1 mRNA水平显著高于正常组织(P<0.001，图2A)，差异倍数均远大于2，且TFF1在基于mRNA表达的前1%的排名中。 其中 Kim 食管癌数据集(P<0.001，差异倍数为173.191)、Kimchi 食管癌数据集(P<0.001，差异倍数为49.848)、食管癌数据集(P<0.001，差异倍数为77.119)。在TCGA中182例ESCA样本中，在肿瘤及肿瘤等级的亚群分析中，同样显示TFF1为高转录，且TFF1在Ⅰ期中表达最高(图2B)。因此，TFF1表达可能是ESCA的潜在诊断指标。

左列代表高表达，右侧代表低表达。 以下参数用作阈值：P<0.000 1，差异倍数 >2 和基因排名前 10%图1 TFF1在不同癌症类型中的mRNA表达

2.3ESCA中TFF1的基因组突变情况 使用cBioPortal根据TCGA数据库中ESCA患者的测序数据，确定ESCA中TFF1改变的类型和频率。265例ESCA患者中有10例(4%)TFF1发生改变。这些改变分别为缺失8例(3%)、扩增2例(1%)，因此，缺失是ESCA中最常见的TFF1突变类型。

此外，Kaplan-Meier图显示，TFF1基因突变与ESCA患者较短的OS有关(图3A，P=0.025 8)。这些结果提示，TFF1基因的突变也可能显著影响ESCA患者的预后。接下来想确定TFF1在ESCA中的生物相互作用网络。为此，使用cBioPortal中的基因网络(Network)，可以进一步分析与TFF1相互作用的基因。网络包含13个节点，包括1个查询基因TFF1和12个TFF1邻近基因。相互作用类型来源于生物途径交换(BioPAX)：浅色连接表示第一种蛋白控制了改变第二种蛋白状态的反应；深色连接表明这些蛋白质是同一复合体的成员。颜色的深浅代表突变的程度。颜色较深节点结包括核受体辅助活化因子1，2，3，雌激素受体1及N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶，这些基因在EACA中突变增加(图3B)。

A:TFF1在ESCA组织和正常组织间的表达；B：在ESCA不同分期TFF1 mRNA的表达图2 TFF1在ESCA中的表达情况及ESCA不同分病理分期中的表达情况(GEPIA)

A：TFF1在遗传改变与较短的OS相关；B：TFF在ESCA中的生物相互作用网络。TFF1是种子基因(用粗边框表示)图3 ESCA中TFF1生物相互作用网络及其与ESCA患者的OS关联的分析(cBioPortal)

2.4ESCA中与TFF1相关的共表达基因分析 利用Linked Omics功能模块分析TCGA中184例ESCA患者的mRNA测序数据。从火山图(图4A)可以看出，5 370个基因(暗红点)与TFF1呈显著正相关，896个基因(暗绿点)与TFF1呈显著负相关。图4B，4C所示为50个与TFF1呈负相关和正相关的重要基因。TFF1显示强阳性表达与钙蛋白酶8(CAPN8，r=0.90，P<0.001)，组织蛋白酶E(CTSE，r=0.89，P<0.001)，再生基因4(REG4，r=0.88，P<0.001)等具有强相关性。

2.5ESCA中与TFF1相关的共表达基因GO和KEGG通路分析 基因集富集分析(GSEA)的GO项分析表明，与TFF1相关的差异表达基因主要位于微体、内质网膜和高尔基体中，主要参与细胞运输、核苷酸-糖代谢过程和内质网转运蛋白等生理过程。它们的分子功能主要有脂酶活性激活、羧酸酯水解酶活性激活及作用于糖基键的水解酶活性激活等(图5A～5C)。KEGG通路分析显示，TFF1可能通过参与NF-κB信号通路，Hippo信号通路等在ESCA中发挥作用(图5D)。

A:TFF1与 ESCA中差异表达基因之间的相关性；B、C：热图显示在ESCA 中与TFF1 正相关和负相关的基因(前 50 名);红色表示正相关，绿色表示负相关图4 ESCA中与TFF1相关的差异表达基因(Linked Omics)

图5 ESCA中TFF1的GO功能注释和KEGG通路富集分析

3 讨 论

TFF1是三种TFF之一，是一种抗蛋白酶肽，其中包含一个保守的三环结构域，称为TFF结构域〔26～28〕，其主要功能是维持胃肠黏膜的完整性，保护和修复受损的上皮细胞〔11〕。TFF3过表达常见于胰腺〔29〕、肝细胞〔30〕、结肠〔31〕、胃癌〔32〕，与肿瘤分级及预后不良有关〔33，34〕。胃癌通常表现为TFF1表达水平降低，TFF1敲除小鼠更容易发生胃癌〔35〕。TFF1在 结肠、胰腺和卵巢肿瘤组织中表达水平较高，与正常肿瘤组织相比，且与刺激细胞存活、迁移、侵袭性和肿瘤扩散相关。表明TFF1是一种潜在的肿瘤标记物〔18～20〕。

本研究结果显示，在ESCA患者中，TFF1过表达，且其mRNA表达与患者的个体癌症分期显著相关。并且发现ESCA患者TFF1的突变率为4%，且缺失是ESCA中最常见的TFF1突变类型，TFF1基因的突变也可能显著影响ESCA患者的预后。功能网络分析表明，TFF1可能通过参与NF-κB信号通路，Hippo信号通路等在ESCA中发挥作用。本研究数据表明TFF1的在ESCC的早期诊断中具有潜在的应用价值。TFF1损伤后上调，参与黏膜完整性的维持，参与胃的个体发生〔36〕。在胃癌中，TFF1的表达减少可以有助于促炎和抗凋亡基因的诱导激活NF-κB途径〔37〕。TFF1在胃中被分为抑癌基因，在其他肿瘤类型中可能也有类似的作用〔38，39〕。例如，在体内和体外，TFF1的缺失增强了乳腺癌细胞系MCF7的致瘤能力。同样，TFF1-KO也通过7，12-二甲基苯蒽(DMBA)诱导的肿瘤发生模型〔39〕，增强卵巢和肺的肿瘤形成。之前的研究表明TFF1在Barrett食管中上调，这是一种癌前状态，会增加食管腺癌发生的风险。我们的结果证实了之前的观察〔40，41〕。这表明TFF1的表达可能是由酸反流引起的损伤引起的，而酸反流与Barrett食管有关。

最近的研究表明，EAC在分子改变方面与胃腺癌相似，而ESCC更接近于头颈部的鳞癌〔42〕。然而，值得注意的是EAC与染色体不稳定性胃癌密切相关，这两种肿瘤明显不同于埃巴病毒感染、微卫星不稳定性和基因组稳定性相关的胃腺癌。由于针对胃癌中TFF1负调控的研究没有考虑到这些分子亚群，因此很难确定TFF1缺失是该类型胃癌的共同特征还是亚群特异性的。研究发现〔43〕，在头颈部癌症患者中，上呼吸消化道的鳞状上皮细胞发生改变。在这种情况下，TFF1在早期食管黏膜中作为生物标志物的表达的改变，与头颈部鳞状细胞癌患者有最大的相关性，不仅可以用作早期诊断，也能显示患者更有可能产生食管第二原发肿瘤(SPTE)。在唾液腺肿瘤中，相对于健康组织〔44〕，TFF1、TFF2、TFF3表达水平较高，而口腔鳞状细胞癌中，TFF2、TFF3表达水平较低，而TFF1表达水平较高。功能网络分析表明，TFF1可能通过参与NF-κB信号通路，Hippo信号通路等在ESCA中发挥作用。具体通过哪个主要途径发挥作用，有待进一步证实。

综上，ESCA患者TFF1高表达与临床癌症阶段等级有关，在肿瘤Ⅰ期表达最高。此外，ESCA患者TFF1的突变以缺失为主及TFF1的基因突变与较短的OS有关。这些结果表明TFF1可能是一种新的肿瘤标志物，为ESCA的诊断和治疗提供新的靶点和策略。