miR-21通过Bcl-2和P53对早期胃癌病理形态学的影响

危柳柳 赖月亮 朱方擎 林晔 谢俊峰

(赣州市人民医院，江西 赣州 341000)

早期胃癌被定义为腺癌局限于胃黏膜或黏膜下层淋巴结存在或不存在转移，其生物学行为与进展期胃癌相比相对良性，目前尚不清楚在2个肿瘤之间是否存在不同的致癌途径，是否与癌症发生的早期和晚期有关〔1，2〕。在胃的发育过程中，胃上皮细胞凋亡的平衡增殖受到干扰，过度的B细胞淋巴瘤(Bcl)-2原癌基因和突变P53蛋白积累〔3〕，两者都在胃癌前病变向癌的进展和转移的调节细胞动力学中起着至关重要的作用〔4〕。大多数早期和晚期胃上皮细胞的转化癌症数据来自日本和东亚，来自西方的人口是有限的〔5〕。本研究探讨miR-21通过Bcl-2和P53对早期胃癌病理形态学的影响。

1 资料与方法

1.1临床标本 江西省赣州市人民医2018年1月至2019年7月期间接受治疗的早期胃癌患者60例。早期胃癌纳入标准：①依据为病理，确诊为早期胃癌；②尚未发生早期胃癌细胞转移；③年龄48～60岁；④所有患者知情并签署同意书。排除标准：①处于复发性早期胃癌；②术前检查有感染和转移；③有其他恶性肿瘤合并；④有肝肾、心血管系统等重大疾病。从每例患者身上取得的癌组织于半小时内分别放入10%甲醛溶液中固定并且石蜡包埋。

1.2主要材料 免疫组化皆使用单克隆抗体，Envision染色系统、抗Bcl-2、抗P53(美国BMI公司)；苏木素-伊红(HE)染色，无水乙醇，稀氨水，二甲苯。

1.3分组 60例早期胃癌患者取得的癌组织通过增加和减少miR-21表达水平分为过表达miR-21组和敲低miR-21组各30例，并随机选取两组各15例患者的癌旁正常组织作为对照组(30例)。

1.4Western印迹 使用RIPA缓冲液(Solarbio，R0010，上海)和抑制剂混合物(Sigma，P8340-5ML，St.Louis，MO，USA)提取细胞和组织的总蛋白质并测定通过二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定法测定蛋白质浓度(SBJ-1001；Beyotime，SENBEIJIA Bio，南京)〔6〕。加入上样缓冲液以调节浓度。变性后，向每个样品孔中加入20 μg。使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS、PAGE)分离蛋白质样品，然后在电泳和跨膜后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜转移相应的蛋白质，用脱脂乳密封2 h〔7〕。将膜与抗-Smurf1(PB0937，1∶1 000；武汉博士德生物技术有限公司，武汉)和抗β-微管蛋白(2146，1∶1 000；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA)一起孵育初级抗体〔8〕。β-微管蛋白用作上样对照。在4℃下过夜孵育。将PVDF膜洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔抗体(抗兔IgG，HRP连接抗体6402-05，1∶5 000；Amylet Scientific Inc，武汉)，并在37℃温育。持续1～2 h。使用电化学发光(ECL)着色剂(Haigene，M2301，哈尔滨)使条带可视化〔9〕。分析靶蛋白β-微管蛋白的灰度比，表明目标蛋白质的相对含量。

1.5免疫组化 针对结直肠癌组织的免疫组化，样本取自癌症最具侵袭性的区域〔9〕。将标本固定在10%甲醛溶液中，包埋在石蜡中，并切成4 μm厚的切片。4 μm厚的切片在二甲苯中脱蜡，并在分级系列乙醇中再水合。切片用2%脱脂乳和5%牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲盐水中孵育，以阻断免疫试剂的非特异性结合。随后，在室温下与单克隆抗MMPs抗体作为一级抗体。然后，用0.3% H2O2处理，抑制内源性过氧化物酶活性30 min，并进行标记链霉亲和素生物素技术。用二氨基联苯胺(DAB)作为显色剂，对其进行评估。

1.6组织学评估 基于德国免疫反应评分〔10〕。染色强度的等级从0到3，0、1、2或3分别表示无染色、弱染色、中等染色或强染色。阳性细胞的百分比评分如下：无染色为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。通过将染色强度所得的分数乘以阳性细胞百分比所得的分数来计算最终分数，结果范围为0～12分。为了将强度评分与临床病理因素进行比较，最终评分0～5分被认为是低表达，6～12分被为高表达。组织学和免疫组化评估由2名不知道患者临床特征的观察者独立进行。在观察者意见不一致的情况下，评估由额外的观察者进行。

1.7HE染色 将早期胃癌组织切片，二甲苯Ⅰ脱蜡进行10 min，此后用二甲苯Ⅱ脱蜡5 min，完成之后用无水乙醇洗去二甲苯，重复清洗3遍，用95%乙醇清洗1 min，90%乙醇清洗1 min，最后用蒸馏水清洗掉乙醇。用苏木素进行染色，保持1 min，再用清水洗涤1 min，1%盐酸酒精分化20 s，清水洗涤3 min，再用1%氨水反蓝30 s，清水洗涤1 min，伊红染色20 s，清水洗涤1 min，然后用85%乙醇脱水20 s，90%乙醇脱水30 s，95%乙醇Ⅰ脱水1 min，95%乙醇Ⅱ 1 min，无水乙醇Ⅰ脱水2 min，无水乙醇Ⅱ脱水2 min，无水乙醇Ⅲ脱水2 min，最后分别用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理2 min，用中性树胶封片完成即可。

1.8统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t检验、单因素方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1miR-21通过Bcl-2和P53对癌组织HE染色的影响 过表达miR-21组胃体和胃窦部黏膜炎症较轻，轻微水肿，上皮细胞坏死脱落，黏膜浅层有淋巴细胞浸润，固有腺体完整；敲低miR-21组病变黏膜固有层内慢性炎细胞浸润，深达黏膜肌层，血管增生，基底部腺体上皮增生，出现共壁现象。见图1。过表达miR-21组的病理组织学情况显著优于敲低miR-21组(P<0.05)。见表1。

2.2miR-21通过Bcl-2和P53对癌组织免疫组化的影响 过表达miR-21组中小部分细胞的胞质染色，呈黄色、棕黄色、棕色、褐色；敲低miR-21组中大部分细胞染色，呈棕色和褐色，在不典型增生、肠化生细胞中呈深褐色。见图2。

图1 miR-21通过Bcl-2、P53对癌组织HE染色的影响(×200)

表1 两组病理组织学情况对比(n=30)

图2 miR-21通过Bcl-2、P53对癌组织免疫组化的影响(×200)

2.3各组Bcl-2、P53的蛋白表达比较 与对照组Bcl-2、P53蛋白表达(0.48±0.03、0.38±0.07)相比，过表达miR-21组Bcl-2蛋白表达(0.17±0.02)显著降低，P53蛋白表达(0.96±0.13)显著上升(P<0.05)；敲低miR-21组Bcl-2蛋白表达(0.63±0.04)显著上升，P53蛋白表达(0.27±0.04)显著降低(P<0.05)。见图3。

图3 各组Bcl-2和P53蛋白表达

3 讨 论

早期胃癌患者进行手术后的生存率可超过90%〔11〕，而转移性早期胃癌患者的淋巴结有1%～3%的局限于胃黏膜，11%～20%局限于胃黏膜下层〔12〕。 诊断是指经验丰富的中心使用高灵敏度和特异性的内镜对肿瘤的浸润程度进行评估〔13〕，判断癌症的发展进程。对胃癌患者进行早诊断、早治疗能够大大提高胃癌患者的生存率、预后水平，因此研究相关诊断指标对胃癌临床治疗具有重要意义〔14〕。

目前只有少数指标被报道可用于胃癌早期诊断，最近有报道表明，细胞凋亡的相关基因对胃癌的发展及预后有影响〔15〕。Bcl-2蛋白被报道能够通过阻断程序性细胞死亡延长各种细胞的存活时间，有研究表明，Bcl-2过表达能够促进胃上皮异常增生，导致胃上皮细胞的恶性转化〔16〕。另外，P53是正常细胞增殖的重要调控因子，野生型P53基因是一种抑癌基因，能够修复损伤的DNA、促进细胞凋亡〔17〕，但突变型P53基因是一种癌基因，抑制细胞凋亡、促进癌细胞增殖，突变型P53 蛋白质常被免疫组化检测〔18〕，有西方学者研究表明，P53蛋白在晚期胃癌的表达中高于早期胃癌〔19，20〕，提示P53蛋白在胃癌发展进程中具有重要作用。目前已知，miR-21在多种肿瘤组织中均呈现高表达，且能够作用于Bcl-2与P53等靶点。

本研究结果显示，miR-21在早期胃癌组织内的过表达会显著升高肿瘤组织内P53蛋白的表达量、降低Bcl-2蛋白的表达量，而高表达P53蛋白和低表达的Bcl-2蛋白都能起到促进癌细胞凋亡的作用，二者共同发挥抑癌作用优化了胃癌组织的病理学形态，延缓了早期胃癌的发展进程，说明在临床能够通过检测或调控miR-21水平对早期胃癌患者进行诊断治疗。

综上，miR-21能够通过升高P53表达、降低Bcl-2表达改善早期胃癌患者胃内理化环境，减少理化损伤，miR-21也可以作为早期胃癌检查的指标，对患者的临床治疗有一定意义，但本研究设计并未涉及对于Bcl-2与P53作用机制的研究，关于miR-21通过Bcl-2和P53对早期胃癌的作用机制有待于进一步研究。