子痫前期患者血清及胎盘组织钙卫蛋白、高迁移率族蛋白B1表达观察

李本祥，韩玉珍，高榕悦，游潘，李金凤，李文雄，黄立锋

1 贵州省黔西南州人民医院重症医学科，贵州兴义 562400；2 首都医科大学附属北京朝阳医院SICU；3 首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科

子痫前期是一种孕期常见的妊娠并发症，严重威胁孕产妇及新生儿的生命安全。子痫前期的发病机制复杂，其具体作用机制目前尚未完全明确。研究［1］表明，子痫前期与炎症免疫过度激活和损伤相关模式分子（DAMPs）紧密相关。DAMPs 是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类物质［2］，可通过Toll 样受体、RIG-1样受体或NOD 样受体等模式识别受体，诱导人体自身免疫或免疫耐受，在关节炎、动脉粥样硬化、肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病的发生发展中发挥重要作用［3］。钙卫蛋白（calprotectin，S100A8/A9）与高迁移率族蛋白B1（High mobility group box-1 pro‐tein，HMGB1）均属于DAMPs。与肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL-6）等早期炎症因子比较，感染、创伤患者外周血中钙卫蛋白与HMGB1 水平升高相对滞后但持续时间较长。因此，钙卫蛋白和HMGB1 被称为“晚期”炎症因子［4-6］，在慢性炎性疾病、脓毒血症、高血压及免疫性疾病的发病中发挥重要作用［7-9］。但目前关于二者在子痫前期发病中的作用相关研究较少。为此我们观察了子痫前期患者血清及胎盘组织钙卫蛋白、HMGB1 表达情况，并分析二者与子痫前期患者病情严重程度的相关性，为探索氧化应激、免疫调控机制在子痫前期发病过程中所起作用提供循证学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020 年10 月—2021 年10 月间于首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科病房及门诊部就诊的子痫前期患者120例（观察组）。根据《妇产科学》（第8版）子痫前期的诊断标准将子痫前期定义为：妊娠20 周后患者收缩压≥140 mmHg 和（或）舒张压≥90 mmHg 伴蛋白尿≥0.3 g/24 h 或随机尿蛋白≥（+）。排除标准：罹患急慢性感染性疾病、慢性高血压、肾病、糖尿病、风湿免疫性疾病、胎膜早破、临产等。观察组年龄（32.0 ± 0.6）岁，BMI（28.2 ± 0.3）kg/m2；收缩压（159 ± 13）mmHg，舒张压（94± 6）mmHg；中晚发型子痫前期69 例、早发型子痫前期51 例；轻度子痫前期42 例，重度子痫前期78例；新生儿体质量（2 715±115）g。另选择正常妊娠孕妇100 例为对照组，其中足月孕妇主要为住院患者，因骨盆狭窄或臀位等因素拟行择期剖宫产术，对照组未足月孕妇主要为门诊患者；对照组年龄（30.0 ± 0.4）岁，BMI（27.0 ± 0.2）kg/m2，收缩压（121±8）mmHg，舒张压（70±4）mmHg，新生儿体质量（3 523±238）g。两组孕妇年龄、孕周及BMI 等一般资料具有可比性（P> 0.05）。与对照组比较，观察组分娩孕周早，新生儿出生体质量低（P<0.05）。该研究为单中心横断面研究，经本院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 两组孕妇血清及胎盘组织钙卫蛋白、HMGB1检测 在终止妊娠前48 小时采集两组患者空腹状态下外周静脉血15～20 mL；非抗凝管内留取血标本约2 mL，3 000 r/min离心5 min，取血清，采用ELI‐SA 法检测两组血清钙卫蛋白、HMGB1。两组孕妇分娩后，均留取直径约1 cm 胎盘组织（母体面，避开梗死及钙化明显区域），10%甲醛液固定后，制作石蜡切片并行免疫组化染色。光学显微镜下观察胎盘组织钙卫蛋白、HMGB1 蛋白表达情况，评分标准参照Shimizu方法，综合阳性细胞所占比例和染色强度进行半定量测定。钙卫蛋白主要表达于胎盘组织间质的中性粒细胞及巨噬细胞中，呈中等强度（++）或弱表达（+）表达。HMGB1在胎盘的滋养细胞、间质细胞及血管内皮细胞的细胞核上均有较强的核染色，将只在核外胞浆内HMGB1染色的细胞作为阳性细胞。阳性细胞所占比例评分标准：未见阳性细胞计0分；阳性细胞表达率<25%计1分；阳性细胞表达率25%～75%计2分；阳性细胞表达率>75%计3分。染色强度评分标准：不着色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计算3分。将阳性细胞所占比例评分与染色强度评分相加即为最终半定量评价结果：0～1分为阴性，2分为弱阳性，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。检测均重复3次，取平均值。主要实验试剂：人钙卫蛋白（S100A8/A9）ELISA 试剂盒购自美国R&D Systems 公司，人HMGB1 ELISA 试剂盒购自北京Expandbio 公司，小鼠抗人钙卫蛋白（S100A8/A9）单克隆抗体和兔抗人HMGB1单克隆抗体购自英国Abcam 公司，3，3 一二氨基苯联胺（DAB）显色剂试剂盒和辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。采用非参数检验分析数据分布的正态性，符合正态分布的计量资料以±s 表示，组间比较采用独立样本间的t检验，多组间比较采用方差分析；非正态分布的计量资料用中位数或四分位数表示组间比较采用Mann-Whitney 检验；计数资料比较采用χ2检验。采用直线相关分析法分析钙卫蛋白、HMGB1 与子痫前期患者病情严重程度的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 终止妊娠前48 小时两组血清钙卫蛋白、HMGB1 水平比较 终止妊娠前48 小时两组血清钙卫蛋白、HMGB1水平比较见表1。

表1 终止妊娠前48小时两组血清钙卫蛋白、HMGB1水平比较（µg/L，±s）

表1 终止妊娠前48小时两组血清钙卫蛋白、HMGB1水平比较（µg/L，±s）

注：与对照组比较，*P<0.05。

分组HMGB1 n 钙卫蛋白观察组对照组72.48±7.57*47.57±3.07 120 100 2 656.76±124.56*1 877.33± 95.69

2.2 两组胎盘组织钙卫蛋白、HMGB1 蛋白表达比较 220例孕妇共收集到195例胎盘组织标本，其中观察组119 例（其中重度63 例、轻度56 例）、对照组76 例。观察组胎盘组织钙卫蛋白表达弱阳性、阳性、强阳性分别为35、53及31例，HMGB1弱阳性、阳性、强阳性分别为36、56及27例；对照组胎盘组织钙卫蛋白表达弱阳性、阳性、强阳性分别为26、35及15例，HMGB1 弱阳性、阳性、强阳性分别为31、37 及8例。与对照组比较，观察组胎盘组织钙卫蛋白、HMGB1 表达综合评价结果在各个水平均较高（P均<0.05）。

2.3 血清钙卫蛋白、HMGB1 表达与子痫患者临床有关指标的相关性 血清钙卫蛋白及HMGB1 水平与子痫前期患者血压升高持续时间均呈正相关（r分别0.886、0.838；P均<0.05）；血清钙卫蛋白、HMGB1 水平与子痫前期患者孕周均呈负相关（r分别为-0.723、-0.731；P均<0.05）。

3 讨论

子痫前期以妊娠20 周后患者出现高血压、蛋白尿为主要临床特征，占孕产妇总数的5%～8%，可导致母体多器官功能损害，增加围产儿的病死率［10］。子痫前期的病因及病理机制一直以来都是人们研究热点，但迄今为止其发病机制尚未完全阐明。目前主要的子痫前期病因学说包括：炎症免疫过度激活、遗传因素、营养元素缺乏及胰岛素抵抗等。炎性反应水平对胚胎成功着床及正常分娩有重要意义，但是过度炎性反应的激活，可导致血管内皮损伤、过度免疫应答等，对妊娠结局而言则具有不良影响。目前，越来越多的证据［11-13］显示，炎症反应的过度激活可能在子痫前期中的发病过程中发挥着重要作用。

近年来关于子痫前期的研究中，比较重要的进展是发现内源性因素，即非感染性因素，也可以通过与病原体相同的途径诱发过度炎性反应，这些内源性分子被称为DAMPs［14］。常见的DAMPs 包括HMGB1、尿酸及IL-1 等，这些指标均与子痫前期的发病密切相关。高迁移率族蛋白B1 是存在于真核生物中的一种非组蛋白核蛋白，能参与DNA 的构成、分化、重组、转录。HMGB1 向细胞外释放，可以促进炎性细胞因子分泌，造成组织损伤或坏死。在子痫前期器官缺氧状态下，HMGB1可以释放到母体血液循环中，进而诱发炎性反应，加重器官损害及疾病进展。研究［15］发现，钙卫蛋白也具有DAMPs的特点，并且在炎性反应中与人们所熟知的HMGB1 分泌特征相似，具有出现相对较晚但持续存在时间较长的特征，因此其与HMGB1 均被称为“晚期炎症因子”，在脓毒症、创伤及慢性炎性疾病等发病过程中有重要的意义。

目前针对HMGB1 在子痫前期中的作用已开展若干研究，但关于子痫前期患者外周循环中HMGB1表达水平与正常妊娠孕妇相比是否存在差异，临床尚存一定争议。有研究［16］发现，在子痫前期患者外周血中HMGB1 水平要高于正常妊娠孕妇，且其胎盘滋养细胞中HMGB1、RAGE 受体及TLR4 受体均呈高表达状态，有些研究则认为子痫前期与正常妊娠血浆中HMGB1 无显著差异。另有研究［17］发现，子痫前期孕妇外周血中钙卫蛋白表达较正常妊娠者明显升高。还有研究表明，金属基质蛋白酶（MMPS）对孕早期胎盘绒毛的浸润及子宫螺旋小动脉的重铸具有重要的作用，而钙—锌结合蛋白质可以抑制MMPS的表达［18］。由于钙卫蛋白也是一种钙—锌结合蛋白，因此推测其在子痫前期的发病过程同样扮演着重要的角色。

在本研究中，我们检测了子痫前期患者血清及胎盘中钙卫蛋白表达，并以同类DAMP 分子HMGB1做为对照，以了解二者与子痫前期疾病进展的内在关系，结果发现，子痫前期患者外周血血清中钙卫蛋白及HMGB1 均较正常妊娠组升高。本研究同时发现，子痫前期中钙卫蛋白及HMGB1水平的升高与子痫前期患者血压升高持续的时间呈正相关，与孕周呈负相关。临床上，患者孕期高血压病程越长，子痫前期发病时孕周越小，钙卫蛋白及HMGB1水平相对越高。由此可见，钙卫蛋白及HMGB1表达水平与子痫前期疾病进展密切相关［18-19］。胎母界面的炎症免疫平衡对于正常妊娠的维持及分娩发挥着至关重要的作用。而过度的炎症反应、促炎因子的大量释放则可能诱发免疫失衡，导致子痫前期或早产等并发症［20］。胎盘组织的免疫组化染色中，钙卫蛋白及HMGB1主要在组织间的中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞中表达，子痫前期中的表达强度高于正常妊娠组，因此推测钙卫蛋白及HMGB1可能参与了子痫前期胎母界面过度炎症免疫反应过程。钙卫蛋白和HMGB1 都可以阻断DC 的分化和抗原提呈作用，进而削弱T 细胞的免疫应答［21］。在变应性过敏性皮炎的的小鼠模型中，发现S100a9-/-树突状细胞可以通过增加细胞因子INF-γ 和IL-17 的分泌，促使T 细胞增殖率升高［22］。单独的S100A8 和S100A8/A9 都可以诱导成熟的具有免疫原性的DC 向不成熟的亚群转化。钙卫蛋白水平与mDC/pDC 亚群比例变化呈正相关［23］。因此推测，子痫前期中钙卫蛋白水平的增高，可能影响了DC表型的变化，导致mDC/pDC比例的上调，从而使机体免疫调节功能下降。

综上所述，子痫前期患者外周血钙卫蛋白、HMGB1 水平升高，胎盘组织中钙卫蛋白、HMGB1表达升高。钙卫蛋白及HMGB1 表达升高与子痫前期病情的进展相关，可能参与了子痫前期疾病发生、发展的病理过程。钙卫蛋白及HMGB1 可能成为预测子痫前期的一种潜在标志物。进一步对不同妊娠时期及子痫前期患者外周血及胎盘组织钙卫蛋白及HMGB1 表达进行深入的、大样本研究，对子痫前期患者的早期筛查和及时干预具有积极的临床意义。