电刺激迷走神经对血管壁c-kit+ 细胞迁移和分化的影响

石柳柳，许振，吴志意，赵金龙，雷佳琦，吴艳△

经皮冠状动脉介入（PCI）是治疗冠心病的有效手段之一，但术后再狭窄是影响其长期疗效的重要因素，新生内膜形成是PCI术后再狭窄的主因［1］。近年有研究发现，在动脉血管壁外膜特别是中外膜交界处存在c-kit 阳性（c-kit+）细胞，当血管受到损伤刺激时，这些c-kit+细胞可向内皮下层迁移并合成大量细胞外基质，参与新生内膜形成［2-3］。因此，探索c-kit+细胞向新生内膜迁移的机制将有助于了解PCI术后再狭窄的机制及寻找新的靶点和治疗策略。研究发现，通过刺激迷走神经减弱交感神经活性，可改变血管内皮功能紊乱，激活胆碱能抗炎系统，抑制动脉粥样硬化等心血管疾病的发生、发展［4-5］。但是迷走神经在血管损伤后新生内膜形成中的作用还不明确，电刺激迷走神经能否通过调控血管壁c-kit+细胞的迁移而影响新生内膜的形成，值得探究。因此，本研究采用大鼠颈总动脉球囊损伤所致血管狭窄模型，观察电刺激迷走神经对血管壁c-kit+细胞迁移到血管损伤处并参与新生内膜形成的作用及机制，为寻求血管狭窄及PCI术后再狭窄的新的治疗靶点和治疗策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 42只SPF级雄性SD大鼠购自湖北医药学院实验动物中心，其中24只12周龄大鼠用于动物模型实验，18只6～8周龄大鼠用于提取原代c-kit+细胞。大鼠由专人饲养，在温度（23±2）℃、相对湿度（55±10）%、昼夜交替各12 h的受控条件下自由进食和饮水。所有动物实验均按照实验动物的饲养和护理的指南进行，经湖北医药学院机构动物护理和使用委员会审查并批准后，根据机构规定进行实验。

1.1.2 实验材料及试剂 乙酰胆碱（Ach）、DMEM/F-12培养基、胎牛血清购自美国Sigma-Aldrich；c-kit一抗、平滑肌22α（SM22α）蛋白一抗、α7 烟碱样乙酰胆碱受体（α7nAChR）一抗、内参（GAPDH）一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、Alexa Fluor 488 偶联二抗和Alexa Fluor 594 偶联二抗均购自英国Abcam；c-kit+细胞筛选磁珠购自德国Miltenyi Biotec；α7nAChR拮抗剂购自美国Selleck；大鼠白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自中国欣博盛；异氟烷购自中国瑞沃德；戊巴比妥钠购自美国Sigma-Aldrich。基础培养基：100 mL 无酚红的DMEM/F-12培养基含有胎牛血清10 mL、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青链霉素和2 mmol/L 谷氨酰胺。干细胞培养基：100 mL 基础培养基中加入白血病抑制因子，其终浓度为10µg/L。血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）诱导平滑肌细胞（SMC）分化培养基：在100 mL 基础培养基中加入PDGF-BB，终浓度为20µg/L。细胞培养所用的T25培养瓶和24孔板等耗材购自美国Thermo 公司。荧光显微镜拍照系统（BX53+DP74）购自日本奥林巴斯（Olympus）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 24只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组（左颈总动脉球囊损伤组）和迷走神经刺激组（左颈总动脉球囊损伤+左侧迷走神经刺激组），每组8只。

1.2.2 大鼠左颈总动脉球囊损伤模型制备 模型组和迷走神经刺激组大鼠行异氟烷麻醉后，仰卧位固定。去除颈部被毛后，于胸骨上端至颌下皮肤做2～3 cm切口。经钝性分离肌层后，游离出一段3～5 cm长的左颈总动脉，再沿左颈总动脉远心端继续钝性分离，以暴露颈内动脉和颈外动脉分叉，在颈外动脉靠头部的位置打结，近心端用动脉夹夹闭左颈总动脉。然后用血管剪在颈外动脉近心端上做一个垂直切口，用血管扩张器将动脉切口轻轻扩开，用镊子轻轻夹住准备好的球囊杆部，将球囊插入动脉切口。取下动脉夹，无出血后继续插入导管，直至导管标记位置（距离球囊端约4 cm）。打开三通开关，经导管向球囊内注入约0.02 mL的无菌生理盐水，关闭三通开关，使球囊保持膨胀状态。转动导管的同时，将其慢慢拉出，至动脉切口位置，重复3次。最后，打结以封闭动脉切口，取下动脉夹，恢复血供，缝合筋膜和皮肤。假手术组大鼠经麻醉、颈部去毛、分离出左颈外动脉后，直接缝合筋膜和皮肤，不进行球囊损伤操作。

1.2.3 电刺激迷走神经 因左侧迷走神经发出支配心脏的传出纤维较少，且以支配房室结为主，刺激时对心率及血压影响相对较小，故选择刺激左侧迷走神经。迷走神经刺激组在左侧颈总动脉球囊损伤后72 h 开始刺激，刺激仪（北京众实迪科技发展有限责任公司，型号：YLS-9A）参数设置如下：电流0.5 mA，电压2 V，单向波，波宽0.3 ms，波间隙49.7 ms，频率20 Hz，间断时间270 s（即每5 min刺激30 s，休息270 s），持续4 h。模型组仅连接刺激仪，但不通电刺激。假手术组既不连接刺激仪，也不通电刺激。

1.2.4 HE染色及免疫组织化学染色 术后14 d，各组均取3只大鼠，麻醉，开胸暴露游离心脏，经左心室插入灌流针并固定，剪开右心耳，生理盐水冲洗，再灌注4%多聚甲醛进行前固定，大鼠在此过程中死亡。之后取左颈总动脉损伤处血管，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，选血管中段位置的切片，HE染色观察血管内膜平均增厚情况，利用Image J软件计算内膜厚度，通过免疫组织化学染色观察c-kit+细胞在血管壁中的分布，利用Image-Pro plus软件计算光密度值。

1.2.5 大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量测定 术后14 d，各组3 只大鼠心脏取血，全血4 ℃静置30 min 后，1 000 r/min于4 ℃离心10 min，分离得到血清，通过ELISA检测血清中TNF-α和IL-6含量。

1.2.6 血管壁c-kit+细胞的分离、纯化及鉴定 利用外膜组织贴块法获取血管壁外膜细胞［6］。取另外18 只SD 大鼠，以2.5 mL/kg剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠。仰卧位固定后，打开胸腹腔，分离主动脉后迅速置于预冷的D-Hank’s液中。加入0.2%（约2 mL）Ⅱ型胶原酶浸泡血管，37 ℃恒温摇床120 r/min消化15 min。擦除内皮细胞，用钟表镊小心仔细地剥离中膜，并舍弃。将剩余的血管外膜用眼科剪剪成约1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块，将其均匀地平铺至T25 培养瓶底部，将培养瓶翻转倒置，置于37 ℃、5%CO2培养箱中。3 h后，轻轻将培养瓶翻转，小心加入干细胞培养基3 mL覆盖组织块，正置于培养箱继续培养。培养72 h 后，于相差显微镜下观察细胞生长情况。待大部分组织块边缘有细胞迁移萌出，更换培养基，此后每72 h更换1次培养基。当细胞生长融合达到约80%时，胰酶消化后按照磁珠筛选说明书，分选得到c-kit+细胞，并经c-kit+免疫细胞化学染色鉴定。

1.2.7 筛选后c-kit+细胞纯度分析及α7nAChR 在细胞中的表达 将磁珠筛选后的细胞按1×104/孔的密度接种在24 孔板中，在干细胞培养基中生长至60%～80%融合时，通过免疫荧光法检测c-kit 标志物的表达。每孔随机读取5 个视野拍照，统计c-kit 阳性细胞的百分率。另外，将磁珠筛选后的c-kit+细胞按1×104/孔的密度接种在24 孔板中，在干细胞培养基中增殖融合至60%～80%时，通过免疫荧光法检测α7nAChR在c-kit+细胞中的表达。

1.2.8 Transwell 实验观察Ach 对c-kit+细胞迁移的影响 取在干细胞培养基培养条件下的c-kit+细胞，分组进行Ach干预，包括对照组（不加入Ach）、1×10-5mol/L Ach 组、1×10-8mol/L Ach组及1×10-5mol/L Ach+α7nAChR拮抗剂组，每24 h换液1次，共培养5 d。c-kit+细胞处理48 h后，Transwell小室放置于预先准备好的24 孔板中，按上述条件培养箱中过夜，向Transwell 小室下室中加入600µL 含体积分数10%胎牛血清的干细胞培养基。用无血清的DMEM/F-12培养液重悬各组细胞，取200 µL 细胞悬液（细胞总数约1×105个）加至Transwell 的上室。48 h后去除下室中的培养液，将小室置于4%多聚甲醛中固定15 min，擦去小室内室膜上的细胞，0.1%结晶紫溶液染色10 min，PBS 漂洗后，显微镜下观察，每孔随机读取5个视野拍照，统计并分析。

1.2.9 Western blot检测Ach对c-kit+细胞分化的影响 c-kit+细胞在SMC 分化培养基条件下，给予Ach 处理，具体细胞分组同1.2.8。取c-kit+细胞裂解液进行SDS-PAGE 电泳，24 V恒压转PVDF 膜45 min。5%脱脂牛奶室温封闭30 min，1×TBST洗膜3次，每次5 min。内参GAPDH和SM22α抗体分别按照1∶5 000 和1∶1 000 稀释。室温孵育2 h，1×TBST 洗3 次后，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育30 min，1×TBST 洗3 次后进行显影。通过Image J 软件进行半定量分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件进行数据处理，Graphpad Prism 8.0 软件作图。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2 组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡情况 纳入24只大鼠，最终死亡3只大鼠，模型组死亡1只，迷走神经刺激组死亡2只。

2.2 各组大鼠新生内膜增厚程度的变化 HE染色结果显示，假手术组、模型组和迷走神经刺激组的内膜与中膜厚度比分别为（5.27±2.41）%、（211.87±12.47）%和（127.00±19.78）%，组间比较差异有统计学意义（F=175.734，P＜0.05）。与假手术组相比较，模型组大鼠新生内膜厚度增加；与模型组相比，迷走神经刺激组新生内膜增厚程度减小，见图1。

Fig.1 Comparison of neointimal thickness in the injured carotid artery between the three groups of rats(HE staining)图1 各组大鼠颈总动脉损伤处血管新生内膜厚度比较（HE染色）

2.3 各组大鼠c-kit+在血管壁中分布及数量变化 免疫组织化学染色显示，假手术组无新生内膜形成，ckit+细胞主要分布于血管壁外膜及中外膜交界处；模型组新生内膜及外膜中均有c-kit+细胞分布，见图2。模型组和迷走神经刺激组新生内膜中的c-kit+平均光密度值分别为0.057±0.010 和0.019±0.001。与模型组相比，迷走神经刺激组新生内膜中c-kit+细胞表达数量减少（t=6.184，P＜0.05）。

Fig.2 Expression of c-kit+in the injured carotid artery between the three groups of rats(DAB staining)图2 各组大鼠颈总动脉损伤处c-kit+细胞（DAB染色）

2.4 各组大鼠血清中炎性因子TNF-α 和IL-6 的水平变化 与假手术组比较，模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6 的水平均升高；与模型组比较，迷走神经刺激后TNF-α和IL-6水平均降低，见表1。

Tab.1 The serum levels of TNF-α and IL-6 in the three groups表1 各组血清TNF-α和IL-6水平（ng/L，±s）

Tab.1 The serum levels of TNF-α and IL-6 in the three groups表1 各组血清TNF-α和IL-6水平（ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05。

组别假手术组模型组迷走神经刺激组F n3 3 3 TNF-α 77.24±0.80 111.03±0.67a 90.11±0.76b 1 587.493＊＊IL-6 160.11±1.80 314.86±2.39a 233.72±2.46b 3 590.572＊＊

2.5 筛选后c-kit+细胞纯度分析及α7nAChR在细胞中的表达 免疫荧光染色显示，筛选后的血管壁外膜细胞大多数均表达c-kit（图3A），c-kit+细胞占比达89%，α7nAChR在c-kit+细胞胞质内表达（图3B）。

2.6 各组c-kit+细胞迁移能力变化 Transwell 实验表明，对照组、1×10-8mol/L Ach 组、1×10-5mol/L Ach组和1×10-5mol/L Ach+α7nAChR 拮抗剂组细胞迁移数目（单位：个/视野）分别为102±7、66±4、57±4 和83±8，组间比较差异有统计学意义（F=28.929，P＜0.05）。与对照组比较，Ach各组c-kit+细胞迁移能力均降低，且以1×10-5mol/L Ach 抑制c-kit+细胞迁移效果最明显，给予α7nAChR 拮抗剂处理后，细胞迁移能力较1×10-5mol/L Ach组升高，见图4。

2.7 各组c-kit+细胞分化能力的变化 Western blot结果显示，ACh 处理后，SM22α 的表达量高于对照组，给予α7nAChR 拮抗剂处理后，SM22α 的表达量较1×10-5mol/L ACh 组降低（F=354.144，P＜0.05），见图5。

3 讨论

PCI 是目前临床上治疗冠心病的一个重要手段［7］。然而，术后再狭窄问题严重影响疗效［8］。自主神经系统由交感神经和副交感神经（迷走神经）组成，两者相互拮抗，在维持血管的结构、功能方面发挥重要作用［9］。迷走神经张力降低是各种心血管疾病的共同特点，电刺激迷走神经已在心力衰竭等心血管疾病治疗中发挥重要作用［10］。目前在临床上，神经电刺激凭借安全、经济、不良反应少等优势成为一种新的物理治疗手段［11］。本研究发现电刺激迷走神经可减轻血管损伤后的狭窄程度。

Fig.3 Characteristics of c-kit+cells and α7nAChR detected by immunofluorescence staining图3 免疫荧光鉴定c-kit+细胞和α7nAChR表达特征

Fig.4 Changes of c-kit+cell migration in each groups(crystal violet staining,×100)图4 各组c-kit+细胞迁移能力变化（结晶紫染色，×100）

Fig.5 The expression levels of SM22α detected by Western blot assay in different groups图5 Western blot检测各组细胞SM22α表达情况

目前研究表明，PCI 术后由于动脉损伤导致的平滑肌细胞增殖及新内膜形成是血管再狭窄的重要因素之一［12-13］。已有研究发现，在血管壁内（特别是外膜和中膜与外膜交界处）存在着能分化成平滑肌细胞的血管壁干细胞，这些细胞在受到损伤刺激时可向内皮下层迁移、增殖，并合成大量细胞外基质，导致新内膜形成［14-16］。c-kit+细胞是一种重要的血管壁干细胞，在血管受到损伤刺激时，可向内皮下层迁移，参与新生内膜形成［17-18］。本研究应用免疫组织化学染色分析发现，迷走神经刺激组的新生内膜中c-kit+细胞数量较模型组减少，表明电刺激迷走神经抑制c-kit+细胞向新生内膜迁移，进而减轻新生内膜厚度。体外分离纯化的原代c-kit+细胞，给予迷走神经递质Ach处理后，细胞迁移能力下降，这一结论与体内动物实验吻合。大量研究表明，Ach 可作用于α7nAChR 受体依赖的信号途径激活抗炎系统［19-21］。为进一步研究Ach 抑制c-kit+细胞迁移的机制，本研究利用α7nAChR 拮抗剂探讨Ach 对ckit+细胞迁移的影响是否也与α7nAChR 有关。首先证实c-kit+细胞能够表达α7nAChR，并发现Ach+α 7nAChR 拮抗剂组的c-kit+细胞迁移数较Ach 组增多，表明Ach 可作用于α7nAChR 受体抑制c-kit+细胞的迁移。本研究中的迷走神经刺激组血清中炎性因子TNF-α和IL-6的表达明显低于模型组，进一步证实电刺激迷走神经促进Ach 释放，而Ach 可进一步与α7nAChR 结合，从而达到激活抗炎系统［22］，抑制血管损伤后新生内膜形成。

有研究表明，小鼠股动脉损伤后，血管壁外膜处的Sca-1+干细胞从外膜迁移至内膜，参与血管重塑，并在到达内膜前发生向平滑肌细胞的转分化现象［14］。本研究体外观察Ach 对c-kit+细胞向平滑肌细胞分化的影响，发现Ach促进c-kit+细胞向平滑肌细胞分化，同时给予α7nAChR 拮抗剂能抑制c-kit+细胞向平滑肌细胞的分化。这一结果表明，Ach 是通过与α7nAChR结合而促进c-kit+细胞向平滑肌细胞分化的。结合Ach 能够直接抑制c-kit+细胞迁移的作用，笔者推测，电刺激迷走神经使得c-kit+细胞迁移至新内膜的数量减少可能与Ach促进血管壁ckit+细胞在到达新生内膜之前已分化为收缩型平滑肌细胞有关。

综上所述，电刺激迷走神经可通过抑制c-kit+细胞向血管损伤新生内膜迁移而减轻PCI术后内膜增生的不良症状。其作用机制与Ach 结合α7nAChR激活抗炎系统、促进其向平滑肌细胞分化有关。但本研究的局限在于体内动物实验中仅观察了动脉损伤时c-kit+细胞在血管壁的分布，未对外膜c-kit+细胞向新内膜迁移给予示踪标记，也未对体内给予Ach 与电刺激迷走神经效果的比较；且机制方面仅检测了α7nAChR 这一种Ach 的受体，未检测Ach 的另外一种受体（M 型受体）是否也参与其中。此外，今后仍需进一步对血管损伤后电刺激迷走神经对c-kit+细胞迁移和分化的信号通路的研究，为电刺激迷走神经应用于PCI 术后再狭窄提供新的理论基础。