尼莫地平调控IRS-1对人脑血管外膜成纤维细胞活力和凋亡的影响①

袁 岗 肖宗宇 李文辉 曹立新 惠超杰 （青海大学附属医院神经外科，西宁 810001）

血管外膜成纤维细胞是组成血管外膜的主要成分，抑制血管外膜成纤维细胞增殖及促进其凋亡对防治心血管疾病具有重要作用［1-3］。IFN-α可促进血管内皮细胞凋亡［4］。目前关于人脑血管外膜成纤维细胞增殖及凋亡的分子机制尚未完全阐明，因而探究其分子机制及积极探寻心脑血管增殖性疾病的治疗药物具有重要意义。研究表明尼莫地平可抑制谷氨酸诱导的神经细胞增殖［5］。胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表达上调可能改善人脑血管内皮细胞功能及促进细胞增殖［6］。但尼莫地平是否可通过调控IRS-1 的表达从而影响人脑血管外膜成纤维细胞活力及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探讨尼莫地平对人脑血管外膜成纤维细胞活力、凋亡的影响及其对IRS-1 的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人脑血管外膜成纤维细胞购自美国ScienCell公司。

1.1.2 药品与试剂 尼莫地平，含量/规格：50 ml/10 mg，生产批号：J20140105，购自拜耳医药保健有限公司广州分公司；IFN-α 购自北京三元基因工程有限公司；DMEM、胎牛血清购自美国Gibco 公司；MTT、DMSO 购自上海碧云天生物技术有限公司；凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000与Trizol 购自美国Invitrogen 公司；反转录与实时荧光定量PCR 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；si-IRS-1、si-con购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗人p21、CyclinD1 抗体购自美国CST 公司；兔抗人Bax、Cleaved caspase-3、Bcl-2 抗 体 购 自 美 国Santa Cruz 公司；兔抗人IRS-1 抗体购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.1.3 仪器 7500 型ABI 荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；FACSCalibur 流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 NC 组：正常培养的人脑血管外膜成纤维细胞；IFN-α 组：用2×106U/L IFN-α 培养人脑血管外膜成纤维细胞；共同处理组：人脑血管外膜成纤维细胞分为IFN-α+Nimo 50 μg/ml组、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 组、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 组，其中IFN-α 浓度为2×106U/L［7］，尼莫地平浓度分别为50、100、200 μg/ml［8］。后续研究将人脑血管外膜成纤维细胞分为IFN-α+pcDNA 组、IFN-α+pcDNA-IRS-1组、IFN-α+Nimo+si-con组、IFN-α+Nimo+si-IRS-1组，其中尼莫地平浓度为200 μg/ml，IFN-α 浓度为2×106U/L。

1.2.2 MTT 检测细胞活力［9］收集各组对数生长期人脑血管外膜成纤维细胞接种至96 孔板（5×103个/孔），分别于转染24 h、48 h、72 h 时加入MTT 试剂（20 μl/孔），继续培养4 h，弃上清，加入DMSO（150 μl/孔），检测各孔在波长490 nm 处的相对吸光度（OD）值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率［10］收集各组对数生长期人脑血管外膜成纤维细胞，预冷PBS 洗涤，4 ℃、3 000 r/min 离心6 min，弃上清，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，按照凋亡试剂盒说明书检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR 检测细胞中IRS-1 mRNA 的表达水平［11］采用Trizol法提取各组细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书操作将总RNA反转录合成cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，参照试剂盒说明书计算IRS-1 mRNA的表达水平。

1.2.5 Western blot 检测IRS-1、p21、Bax、Cleaved caspase-3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达［12］提取各组细胞总蛋白，SDS-PAGE 分离蛋白，转膜，封闭2 h，孵育（IRS-1 稀释比1∶800、p21 稀释比1∶1 000、Bax 稀释比1∶1 000、Cleaved caspase-3 稀释比1∶1 000、CyclinD1 稀释比1∶800、Bcl-2 稀释比1∶800）一抗稀释液，孵育IgG 稀释液（1∶5 000），TBST 洗涤，滴加ECL，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料均符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验，数据均以±s表示，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 尼莫地平对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞活力的影响 与NC 组比较，IFN-α 组细胞活力降低（P<0.05），p21 蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P<0.05）；与IFN-α 组比较，IFN-α+Nimo 50 μg/ml组、IFN-α+Nimo 100 μg/ml组、IFN-α+Nimo 200 μg/ml组细胞活力升高（P<0.05），p21蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1 蛋白水平升高（P<0.05），见图1、表1。

表1 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表1 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell viability/%Groups p21 CyclinD1 48 h 0.74±0.06 0.45±0.031）0.53±0.042）0.61±0.052）0.66±0.042）18.632 0.000 72 h 1.16±0.09 0.71±0.071）0.88±0.062）0.96±0.082）1.03±0.112）12.081 0.001 NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml F P 0.15±0.04 0.67±0.061）0.48±0.052）0.45±0.052）0.32±0.042）45.581 0.000 0.74±0.04 0.22±0.031）0.35±0.042）0.48±0.062）0.54±0.072）46.048 0.000 24 h 0.32±0.04 0.29±0.03 0.32±0.03 0.30±0.04 0.31±0.04 0.386 0.814

图1 Western blot 检测人脑血管外膜成纤维细胞中p21和CyclinD1蛋白表达Fig.1 Western blot was used to detect p21 and CyclinD1 protein expressions in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.2 尼莫地平对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞凋亡的影响 与NC 组比较，IFN-α 组细胞凋亡率升高（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）；与IFN-α组 比 较，IFN-α+Nimo 50 μg/ml 组、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 组、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 组细胞凋亡率降低（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），见图2、表2。

表2 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表2 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell apoptosis rate/%3.51±0.32 21.84±2.231）14.39±1.152）9.18±1.032）8.37±0.942）87.331 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP Bax 0.25±0.03 0.72±0.071）0.58±0.062）0.48±0.052）0.43±0.052）31.844 0.000 Bcl-2 0.64±0.04 0.25±0.031）0.37±0.042）0.46±0.052）0.52±0.052）36.049 0.000 Cleaved caspase-3 0.13±0.02 0.67±0.061）0.51±0.052）0.38±0.042）0.28±0.042）66.696 0.000

图2 Western blot 检测人脑血管外膜成纤维细胞中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达Fig.2 Western blot was used to detect protein expressions of Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.3 尼莫地平对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞IRS-1 表达的影响 与NC 组比较，IFN-α 组IRS-1 mRNA 及蛋白水平降低（P<0.05）；与IFN-α 组比较，IFN-α+Nimo 50 μg/ml组、IFN-α+Nimo 100 μg/ml组、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 组IRS-1 mRNA 及蛋白水平升高（P<0.05），见图3、表3。

表3 尼莫地平对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞IRS-1 mRNA和蛋白表达的影响（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi⁃tia fibroblasts（±s，n=3）

表3 尼莫地平对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞IRS-1 mRNA和蛋白表达的影响（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi⁃tia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

IRS-1 protein 0.67±0.06 0.19±0.031）0.33±0.042）0.47±0.052）0.59±0.062）46.230 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP IRS-1 mRNA 1.05±0.08 0.21±0.031）0.42±0.052）0.73±0.082）0.87±0.092）71.160 0.000

图3 Western blot 检测人脑血管外膜成纤维细胞中IRS-1蛋白表达Fig.3 Western blot was used to detect expression of IRS-1 protein in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.4 过表达IRS-1对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞活力和凋亡的影响 与IFN-α+pcDNA 组比较，IFN-α+pcDNA-IRS-1 组细胞活力升高（P<0.05），细胞凋亡率降低（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），见图4、表4。

图4 人脑血管外膜成纤维细胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表达以及细胞凋亡情况Fig.4 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2，Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表4 过表达IRS-1 对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro⁃tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表4 过表达IRS-1 对IFN-α 对人脑血管外膜成纤维细胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro⁃tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+pcDNA group，1）P<0.05.

Cell apopto⁃sis rate/%20.754±2.07 11.35±1.431）6.474 0.003 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.65±0.05 0.41±0.041）6.492 0.014 Cell viability/%24 h 0.31±0.04 0.34±0.03 1.039 0.357 48 h 0.54±0.04 0.67±0.051）3.517 0.025 72 h 0.76±0.06 1.04±0.071）5.260 0.006 IFN-α+pcDNA IFN-α+pcDNA-IRS-1 t P 0.38±0.04 0.52±0.051）3.787 0.019 0.74±0.06 0.41±0.041）7.926 0.001 0.32±0.04 0.58±0.051）7.033 0.001 0.64±0.06 0.25±0.031）10.070 0.000 0.27±0.04 0.43±0.051）4.328 0.028

2.5 沉默IRS-1 部分逆转尼莫地平对人脑血管外膜成纤维细胞的作用 与IFN-α+Nimo+si-con 组比较，IFN-α+Nimo+si-IRS-1 组细胞 活力降 低（P<0.05），细 胞 凋 亡 率 升 高（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05），见图5、表5。

图5 人脑血管外膜成纤维细胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋 白表达及维细胞凋亡情况Fig.5 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表5 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres⁃sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表5 尼莫地平对IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres⁃sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+Nimo+si-con group，1）P<0.05.

Cell apopto⁃sis rate/%10.75±1.08 15.36±1.251）4.834 0.008 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.23±0.02 0.41±0.041）6.971 0.002 Cell viability/%24 h 0.34±0.04 0.31±0.03 1.039 0.357 48 h 0.72±0.05 0.61±0.041）2.976 0.041 72 h 1.03±0.09 0.79±0.061）3.843 0.018 IFN-α+Nimo+si-con IFN-α+Nimo+si-IRS-1 t P 0.67±0.06 0.45±0.051）4.879 0.008 0.31±0.04 0.49±0.061）4.323 0.012 0.54±0.05 0.25±0.031）8.614 0.001 0.31±0.04 0.75±0.031）15.242 0.000 0.71±0.08 0.36±0.031）7.095 0.002

3 讨论

血管增殖性疾病与血管重构的发展有关，而人脑血管外膜成纤维细胞与心脑血管疾病密切相关［13-14］。但仍有部分药物对血管增殖性疾病的治疗及其作用机制尚未阐明。

尼莫地平可通过抑制炎症反应从而减轻神经功能损伤［15］。尼莫地平可保护多巴胺能神经元，其作用机制可能是抑制炎症因子表达而发挥作用［16］。尼莫地平能够降低炎症因子水平而减轻炎症反应从而恢复神经功能［17］。但尼莫地平在治疗神经相关疾病中的作用机制尚未完全阐明，本研究结果显示IFN-α 处理后人脑血管外膜成纤维细胞活力降低，与上述研究结果相似，而不同浓度的尼莫地平处理后细胞活力升高，提示尼莫地平可增强IFN-α诱导的脑血管外膜成纤维细胞活力。本研究结果显示IFN-α 处理后脑血管外膜成纤维细胞中p21 表达上调，CyclinD1表达下调，而不同浓度的尼莫地平处理后p21 表达下调，CyclinD1 表达上调，与相关报道结果相似，提示尼莫地平可能通过调控细胞周期从而增强脑血管外膜成纤维细胞活力［18］。本研究结果显示IFN-α 处理后脑血管外膜成纤维细胞凋亡率升高，Bax、Cleaved caspase-3 表达上调，Bcl-2 表达下调，而尼莫地平处理后细胞凋亡率降低，Bax、Cleaved caspase-3 表达下调，Bcl-2 表达上调，提示尼莫地平可抑制脑血管外膜成纤维细胞凋亡。

miR-126 可通过靶向IRS-1 而在神经胶质瘤中发挥抑癌作用［19］。本研究结果显示IFN-α 处理后脑血管外膜成纤维细胞中IRS-1 表达下调，尼莫地平处理后可促进IRS-1 的表达，进一步分析显示IRS-1过表达后细胞活力升高，细胞凋亡率显著降低，p21、Bax、Cleaved caspase-3 表 达 下 调，CyclinD1、Bcl-2表达上调，提示IRS-1 过表达可增强细胞活力及抑制细胞凋亡。同时本研究结果显示抑制IRS-1 的表达后，细胞活力降低，细胞凋亡率升高，提示抑制IRS-1 的表达可明显减弱尼莫地平对人脑血管外膜成纤维细胞的作用。

综上所述，尼莫地平可增强IFN-α 诱导的人脑血管外膜成纤维细胞活力及抑制细胞凋亡，其作用机制可能与上调IRS-1 的表达有关，可为尼莫地平治疗血管增殖性疾病提供实验依据。