外泌体对M2型巨噬细胞的调控及其在心血管疾病中的作用①

张祥凝 党国徽 冯 娟 （北京大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100191）

我国心血管疾病发生率逐年上升，对国民健康造成极大危害。在多种心血管疾病相关免疫调节、组织重构和代谢调节中，巨噬细胞均起关键作用［1］。巨噬细胞在不同刺激下表现为不同类型，诱导性表达更多的一氧化氮合酶（inducible nitric oxide syn⁃thase，iNOS）或精氨酸酶，并相应地被称为M1 型及M2 型巨噬细胞。其中M1 型巨噬细胞活化时分泌IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-10 等促炎细胞因子；M2 型巨噬细胞活化时分泌IL-23 等抑炎细胞因子，具有免疫抑制作用，参与组织器官重塑。心血管疾病发生发展的原因之一即促炎M1 型巨噬细胞和抑炎M2 型巨噬细胞调控失衡。相对于M1 型巨噬细胞，M2型巨噬细胞与心血管疾病关系的研究起始相对较晚，认识不够充分。外泌体作为细胞间信号传导的递质，参与调节巨噬细胞极化，并参与M2 型巨噬细胞与其他细胞的信息传递及其介导的抑制炎症、组织修复等过程，在心血管疾病发生发展中具有重要作用。本文将综述外泌体对M2 型巨噬细胞的调控及其与心血管疾病的联系及相关研究进展。

1 M2型巨噬细胞与心血管疾病

M2型巨噬细胞具有高度表型异质性，调控机体免疫与代谢，维持正常组织稳态。如Kupffer细胞与脂肪组织巨噬细胞等组织驻留巨噬细胞通常维持M2 型［2］。M2 型巨噬细胞在心血管疾病中具有重要保护作用，如抑制血管炎症反应，从而抵抗动脉粥样硬化，调控高血压时的血管重塑等。早期动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞主要为M2 型，因此不易发生过度急性炎症。斑块中巨噬细胞随疾病进展逐渐转变为以M1 型为主，也提示M2 型巨噬细胞在调控正常血管稳态中的作用［3］。此外，M2 型巨噬细胞利于炎症消退与细胞外基质降解，为组织修复创造有利条件，或诱导成纤维细胞活化及迁移，以及通过上调TGF-β1 水平促进炎症损伤后期纤维增生性修复［4-6］。M2 型巨噬细胞在组织浸润巨噬细胞中的比例影响多种心血管疾病进程。

2 外泌体对M2型巨噬细胞的调控

外泌体是一种细胞外囊泡，携带脂质、蛋白质、核酸等作用于靶细胞，进而实现细胞间信息传递。心血管疾病中，包含于外泌体中的微小RNA（microRNA，miRNA）、转录因子及其他非编码RNA调控M2型巨噬细胞极化和功能。

外泌体对M2 型巨噬细胞极化的调节与外泌体组织来源有关。心血管系统中，内皮细胞、干细胞与脂肪细胞等为参与疾病发展的重要细胞类型。本文将根据外泌体组织来源对其分类，分别讨论每种细胞来源的外泌体所含物质、对M2 型巨噬细胞极化的调节、相关信号通路及其对心血管疾病的影响。

2.1 内皮细胞来源外泌体 血管内皮细胞来源外泌体调节靶细胞增殖、凋亡及迁移过程，对血管生成、免疫应答具有重要调控作用。内皮细胞释放的外泌体中miR-155与肺癌转移相关转录本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）调控M2 型巨噬细胞极化，在动脉粥样硬化等多种心血管疾病及缺血再灌注损伤中具有重要意义。

2.1.1 miR-155抑制M2型巨噬细胞极化 miR-155在炎症刺激、心脏疾病、动脉粥样硬化等条件下表达增加，抑制M2 型巨噬细胞极化，促进M1 型巨噬细胞极化，从而发挥免疫调节作用［7］。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）中，氧化低密度脂蛋白（oxidation low-density lipopro⁃tein，ox-LDL）及Krueppel 样 因 子2（Krueppel-like factor 2，KLF2）是调节miR-155 表达的重要分子［8］。ox-LDL 通过上调核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路活性促进miR-155表达，使外泌体中miR-155 含量增加；KLF2 通过竞争cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein，CBP）/p300 抑 制NF-κB 信 号 通 路，使 外 泌 体 中miR-155 含量减少，且KLF2 介导的miR-155 表达调控、M2型巨噬细胞极化调控与动脉粥样硬化斑块形成相关［8］。

2.1.2 MALAT1促进M2型巨噬细胞极化 HUVEC来源外泌体MALAT1 促进M2 型巨噬细胞极化，可能与MALAT1 诱导的巨噬细胞内吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase1，IDO）表达增加有关［9］。MALAT1 促进血管内皮细胞增殖，参与血管内皮损伤修复，而血管内皮损伤被认为是早期动脉粥样硬化与糖尿病微血管病变发生过程中的关键步骤。同时MALAT1 在心肌细胞凋亡、炎症反应、纤维修复及心脏重构等过程中具有重要意义，与心肌梗死引发的心肌损伤、纤维化及糖尿病性心肌病心肌重构密切相关［10］。

2.2 间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exo）促进M2 型巨噬细胞极化 干细胞促进心肌细胞修复再生、改善其收缩功能，在冠状动脉疾病、心肌梗死、心肌衰竭等心血管疾病的治疗中具有良好应用前景［11］。MSC具有多向分化、造血支持、免疫调控等特点，在心血管疾病治疗中报道较多［12］。MSC 及MSC-Exo 能够使M1 型巨噬细胞向M2 型转化，促进心脏组织修复，发挥心脏保护作用［13］。

骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesen⁃chymal stem cells，BMSCs）、人脐带间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）等多种MSC及其来源外泌体在心血管疾病中具有重要意义。其中，BMSCs 应用最为广泛，其来源的外泌体通过IL-6 等促进M2 型巨噬细胞极化，影响T细胞免疫应答过程，进而发挥心肌保护效应［11］。

MSC-Exo 中包括miR-let7、miR-182、miR-146a、miR-223 等，目前研究较多的是miR-223。miR-223在人外周血单核细胞及BMSCs 中均呈高表达，并被包装进入外泌体，是介导过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）在巨噬细胞内作用的重要分子；PPARγ 与miR-223 基因启动子上的PPARγ 调控元件结合，上调miR-223 表达［14-16］。研究指出，miR-223 存在于MSC-Exo，抑制Pknox1基因表达而促进M2型巨噬细胞极化［14］。同时，YING 等［16］发现Pknox1 是miR-223的一个靶基因，但Pknox1 表达上调与下调仅影响M1型巨噬细胞活性，对M2型巨噬细胞影响有限，随后，其找到了miR-223 新的靶基因，即Ras GTP 酶激活蛋白1（Ras GTPase activating protein 1，Rasa1）与活化T 细胞核因子5（nuclear factor of activated Tcells 5，Nfat5），并最终证实miR-223 通过下调Rasa1与Nfat5 表达实现对M2 型巨噬细胞的调节。此外，miR-let7 可促进巨噬细胞迁移与M2 巨噬细胞极化，改善动脉粥样硬化，参与M2 型巨噬细胞相关组织修复过程［17-18］；miR-182促进心肌缺血再灌注早期心肌内M1 型巨噬细胞向M2 型转化［19］；miR-146a 在动脉粥样硬化的血管内皮细胞、平滑肌细胞、斑块中的单核巨噬细胞内均有表达，具有抗炎作用［20］。高水平的miR-146a可缓解动脉粥样硬化［21］。

ADSCs 来源外泌体作用于STAT6 及V-MAF 肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（V-maf musculoapo⁃neurotic fibrosarcoma oncogene homolog B，MafB），从而促进M2 型巨噬细胞极化［22］。其中，STAT6 促进M2 型巨噬细胞极化，抑制炎症，稳定动脉粥样硬化斑块；MafB 作用于编码补体C1q、黑色素瘤缺乏因子（absent in melanoma，AIM）、巨噬细胞清道夫受体1（macrophage scavenger receptor type Ⅰ，MSR1）、嘌呤受体P2X 配体门控离子通道4（purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 4，P2RX4）等多种蛋白的基因，在自身免疫病、动脉粥样硬化等疾病中发挥调控作用。

2.3 脂肪细胞来源外泌体 脂肪细胞可释放外泌体miRNA，调节外周其他组织基因表达，同时也是循环血中miRNA 的主要来源。脂肪细胞诱导骨髓前体细胞向脂肪组织巨噬细胞分化，同时调节巨噬细胞功能［23-24］。脂肪细胞外泌体中miR-34a 通过抑制KLF4、肝X 受体α（liver X receptor alpha，LXRα）表达而抑制M2型巨噬细胞极化［25-26］。此外，miR-34a作用于组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1），调控组蛋白H3第9位赖氨酸残基（H3K9）乙酰化，与泡沫细胞中脂质积累相关；抑制miR-34a将促进巨噬细胞胆固醇流出，有利于动脉粥样硬化斑块稳定［27-28］。

3 外泌体调控M2巨噬细胞功能的相关细胞内信号转导通路

来源于外泌体的上述不同种类miRNA、转录因子及其他非编码RNA 通过不同信号通路调节M2型巨噬细胞极化，相关信号通路包括Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB 信号通路、磷脂酰 肌 醇-3- 激 酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein-serinethreonine kinase，AKT）信号通路、Notch 信号通路、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/STAT信号通路、TGF-β信号通路和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1 phosphate，S1P）信号通路等，总结如下。

3.1 TLR4/NF-κB 信号通路 NF-κB 在炎症反应中发挥核心调控作用。非激活状态下，NF-κB 活性受IκB 抑制；而受到TLR 及TNF 受体等细胞因子受体刺激后，IκB 激酶激活将使IκB 磷酸化，进而使蛋白酶体降解并释放NF-κB 向核内转运，激活相应基因转录［29］。MSC-Exo 使IκBα 表达增加、p-IκBα 表达减少，下调NF-κB信号通路可抑制NF-κB核转位，促进M2 型巨噬细胞极化，同时促进抑炎细胞因子IL-10释放，使促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β 含量显著降低，最终抑制炎症［13］。这些外泌体内物质主要包括miR-146a、miR-let7、miR-182、miR-223等，分述如下。

MSC-Exo 中的miR-146a 抑制巨噬细胞内白细胞介素-1受体相关激酶1（IL-1 receptor associated ki⁃nase，IRAK1）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）及干扰素调节因子5（interferon regulatory 5，IRF5）表达，抑制NF-κB通路活性，促进M2 型巨噬细胞极化，从而抑制动脉粥样硬化斑块形成、减轻心脏缺血再灌注损伤等［20］。miR-146a 与IRAK-1、TRAF6、磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-acti⁃vated protein kinase，p-p38 MAPK）等相互作用，抑制p38 MAPK介导的RNA结合基序蛋白4（RNA-binding motif protein 4，RBM4）Ser309 磷酸化与RBM4 在细胞核内重新定位并发挥功能，从而减少TNF-α、IL-6等促炎细胞因子合成，抑制过度炎症发生。其中，RBM4 磷酸化能够抵消TLR4 导致的促炎细胞因子翻译抑制。miR-146a 也通过诱导MAPK 磷酸酶表达下调MAPK 通路活性，同时使IRAK1 与TRAF6 表达减少，从而抑制NF-κB活化［30］。

miR-let7 作用于高迁移率族AT-hook 蛋白2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）基因，抑制NF-κB 信号通路，促进M2 巨噬细胞极化［17］。同时，miR-let7 调 控miR-let7/HMGA2/NF-κB 通 路 而 促 进M2 巨噬细胞极化而使ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化得以改善。此外，miR-let7 调控miR-let7/胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）/磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）通路而抑制动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润［17］。miR-182 下调TLR4/髓样分化因子（myeloid dif⁃ferentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 通路使巨噬细胞内iNOS、TLR4、MyD88 和NF-κB p-P65 表达显著下降，从而抑制巨噬细胞向M1型转化［19］。miR-223 抑制NF-κB p65 磷酸化，从而抑制巨噬细胞NF-κB 通路。miR-223 减少将上调Ras 同源基因家族、Rho 相关GTP 结 合 蛋 白（Rho-related GTP-binding protein，Rho B）基因表达，诱导NF-κB 及MAPK 信号通路活化，使LPS 诱导下巨噬细胞中TNF-α、IL-6 及IL-1β合成增加［25］。

3.2 PI3K/Akt 信号通路 PI3K/Akt 信号通路是巨噬细胞功能调节的中心，与TGF-β、IL-10 等多种细胞因子对M2 型巨噬细胞调节相关。PI3K/Akt 信号通路可由TLR4 激活，同时作为TLR 与NF-κB 信号通路抑制物，促进M2 型巨噬细胞极化。结节性硬化复合体（tuberous sclerosis complex，TSC）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of ra⁃pamycin complex-1，mTORC1）通路位于PI3K/Akt通路下游，但其对巨噬细胞极化的调节方向尚无定论［31］。MSC外泌体miR-182可上调p-PI3K与p-AKT表达，其可能机制为miR-182抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，从而反馈性激活PI3K/Akt 通路，促进M2 型巨噬细胞极化［19］。MSC-Exo 也可使M2 型巨噬细胞中AKT1 基因及M1 型巨噬细胞中AKT2 基因表达增加，使M1型巨噬细胞向M2型转化［13］。此外，miR-let7作用于IGF2BP1 基因，通过miR-let7/IGF2BP1/PTEN调节轴抑制动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润；其中PTEN 将3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇转化为4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，拮抗PI3K作用［31］。

3.3 Notch 信号通路 Notch 活化可通过其下游的发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）抑制信号调节蛋白（signal regulatory protein α，SIRPα）表达，从而抑制M2 型巨噬细胞极化［32］。Notch1 抑制可完全抵消LPS 诱导的IL-1β、IL-6 和趋化因子（C-C 基序）配体2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL-2］表达增加及NF-κB 通路激活［33］。MSC-Exo 通过miR-146a 抑制Notch1 信号途径，或通过miR-146a 抑制Notch 信号通路的下游基因Hes1部分抑制Notch1，促进M2型巨噬细胞极化［34-35］。

3.4 JAK/STAT 信号通路 STAT6是巨噬细胞重要的转录因子。ADSC 来源外泌体作用于STAT6，磷酸化STAT6 活化Wnt-catenin 信号通路，促进M2 型巨噬细胞极化［22，36］。STAT6也可与三重基序蛋白24（tripartite motif-containing 24，Trim24）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）结 合 蛋 白（CREB-binding protein，CBP）形成复合物，再由CBP 催化STAT6 的Lys383乙酰化，从而抑制M2型巨噬细胞极化［37］。

脂肪细胞外泌体miR-34a 促进脂肪组织巨噬细胞胞质中的STAT3 向核内转移，进而促进iNOS 合成，抑制M2 型巨噬细胞极化，促进脂肪组织炎症反应［25］。另外，STAT3 可直接通过外泌体运输进入靶细胞。脂肪源性干细胞来源外泌体通过转运磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，p-STAT3）上调精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）表达，促进M2 型巨噬细胞极化，进而缓解由LPS 与IFN-γ 引发的炎症反应［38］。

3.5 TGF-β 信号通路 TGF-β 在细胞与组织生长、发育及分化中起关键作用。TGF-β上调抑炎细胞因子IL-10、下调促炎细胞因子TNF-α 及IL-12表达，促进M2 型巨噬细胞极化。这个过程由TGF-β 诱导的锌指蛋白转录因子SNAIL 过表达实现，而TGF-β 诱导SNAIL 过表达又需要SMAD2/3 及PI3K/Akt 信号通路参与［39］。

ADSC 来源外泌体促进M2 型巨噬细胞极化，同时抑制TGF-β1 表达，抑制TGF-β/Smad 信号通路介导的Ⅰ型、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，α-SMA）参与的心肌纤维化，发挥心肌保护作用［40］。

3.6 S1P 信号通路 鞘氨醇激酶1 和2（sphingosine Kinase1/2，SphK1/2）可催化鞘氨醇磷酸化，产生S1P；SphK/S1P 在血管内皮细胞功能调节、血管新生等病理生理过程中发挥重要作用。S1P 通过多种机制诱导M2 型巨噬细胞极化，包括磷酸化STAT6，从而诱导细胞因子信号转导抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）表达增加、SOCS3 表达减少，以及通过活化细胞外调节蛋白激酶（extracel⁃lular regulated protein kinases，ERK）、抑制p38 MAPK与c-Jun 氨 基 末 端 激 酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）使IL-4 分泌增加。体内实验中，经S1P 处理的M2 型巨噬细胞在ox-LDL 诱导下的脂质积累被显著抑制［41］。血清中S1P 与高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）结合，在HDL中含量为所有脂蛋白中最高。PARK 等［41］认为，S1P 诱导的M2 型巨噬细胞极化与HDL抗动脉粥样硬化作用密切相关。ADSC来源外泌体可促进M2 型巨噬细胞极化，抵抗心肌梗死引发的炎症反应及心肌纤维化。下调S1PR1表达使NF-κB 与TGF-β 表达增加，抵消上述作用。有实验表明S1pr1 沉默将促进M1 型巨噬细胞极化，且与NF-κB表达增加有关［42］。

4 小结与展望

近年我国心血管疾病发生率呈上升趋势。调节心血管疾病的各种组织细胞中，巨噬细胞参与动脉粥样硬化、心肌梗死等多种心血管疾病发生发展过程。M2型巨噬细胞可抑制炎症反应、促进细胞外基质降解，在心血管疾病中为组织修复、血管重塑等创造有利条件。M2 型巨噬细胞已成为心血管疾病新药物的靶点，如人参皂苷Rb1、他汀类药物、谷氨酰胺和2-脱氧葡萄糖等多种药物均可通过促进M2型巨噬细胞极化治疗动脉粥样硬化［43-45］。

M2 型巨噬细胞极化及其生理功能可由外泌体调控。外泌体内容物多样性使其具有多重生物学功能，可通过多种信号通路调控M2 型巨噬细胞极化、巨噬细胞代谢与功能，这样的多向靶点调节优势使外泌体能够对受体细胞产生整体调节效应，进而调节心血管疾病炎症反应及组织修复等。相关研究通过检测心血管疾病患者与健康人群体内外泌体内容物表达差异，探寻潜在生物标志物，从而为心血管疾病诊疗提供更精准的靶标提供了思路，在心血管疾病治疗中具有良好应用前景［46］。此外，外泌体的相对稳定性与天然物质转运特性使外泌体作为新型药物载体、发挥靶向给药作用成为可能。

外泌体成分多样性及其作用特异性是外泌体在心血管疾病应用中的优势，同时也增加了相关研究的复杂性，对分子机制研究的精确性、全面性及外泌体纯化及鉴定技术均提出了更高要求，需要对现有分离富集、鉴定分析技术具有更加充分的了解，寻找更加精确的分析技术及手段。