系统性红斑狼疮患者miRNA异常在TLR7/9-IFN通路中的作用机制

张汉清 邬秀娣（宁波大学医学院，宁波 315211）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种典型自身免疫性疾病，可累及多个器官与系统。其发病机制涉及免疫、遗传和环境危险因素等相互作用［1］。miRNA 是一类内源性非编码小RNA，长度为19～25 个核苷酸，通过降解特定靶mRNAs 或抑制其翻译，转录后负向调节基因表达［2］。近年来，广泛研究表明miRNA 异常在SLE 发病机制中起关键作用，其机制包括T、B 细胞自身反应性上调、Ⅰ型干扰素（IFN）通路激活等［3］。Toll 受体（Toll-like receptor，TLR）是一种模式识别受体，目前认为TLR7/9 信号通路为SLE 患者Ⅰ型IFN 产生的主要机制（图1），在SLE 发病机制中占据重要地位［4］。本文主要阐述miRNA异常对TLR7/9-IFN 通路的影响，希望为寻找与SLE 发病机制相关的新靶向药物提供思路。

图1 SLE中TLR7/9-IFN信号通路［4］Fig.1 TLR7/9-IFN signalling pathway in SLE［4］

1 TLR7/9-IFN通路与SLE

1.1 TLR7/9-IFN 通路与性别差异 2006 年，BERGHÖFER 等［5］首次证实健康人群存在一种性别依赖的IFN-α诱导途径，即TLR7会诱导女性外周血淋巴细胞产生更多IFN-α，并排除与雌激素信号、TLR7 基因X 失活逃逸相关，而TLR9-IFN-α 途径则无此性别差异。2018年WEBB等［6］采用青春期前与青春期后健康年轻人、接受跨性激素治疗的变性人（即出生性别为女性的人服用睾酮，出生性别为男性的人服用雌二醇）及患有特纳综合征的年轻女性组成试验模型，解除X 染色体数量与性激素环境之间的传统相关性。这种独特的试验模型提示：①女性性别和青春期后阶段是人体内TLR7诱导IFN-α 产量较高的独立相关因素，具体来说，如果存在两条X染色体，无论血清性激素水平如何，浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）在TLR7 刺激后特异性产生更多Ⅰ型IFN；且仅1条X染色体存在时，Ⅰ型IFN 水平与睾酮呈正相关，存在两条X 染色体时则与睾酮呈负相关；②青春期后女性TLR7 基因表达上调；③IFN 刺激后，青春期后志愿者体内外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）IFN 诱导基因（IFN-stimulated gene，ISG）表达上调，其水平与血清雌二醇浓度呈正相关。以上发现可能解释女性性成熟时儿童SLE（jSLE）易感性增加的原因。WEBB 等［6］对青春期后健康年轻人及年龄相匹配的低疾病活动度jSLE 患者（两组样本间血清睾酮、雌二醇浓度、IFN 产量差异无统计学意义）进行分析，发现PBMC TLR7 表达在jSLE 组无性别差异，男性jSLE 患者PBMC TLR7 基因表达水平显著高于健康男性志愿者，提示TLR7 过度表达可能是男性jSLE 发生的一个重要因素。SHEN 等［7］证实东亚人群TLR7 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs3853839（G/C）在SLE 患病风险中有性别差异，男性SLE 患者频率显著高于女性对照组，其可通过上调TLR7-Ⅰ型IFN 通路表达，参与SLE发生。

与性别差异有关的TLR7-IFN 通路给SLE 分子发病机制带来新见解，也为男女性患者精细化治疗提供研究方向。

1.2 TLR7/9-IFN 通路与动脉粥样硬化 ROMAN等［8］发现各年龄段SLE 患者动脉粥样硬化患病率均高于健康对照组，40 岁以下年轻患者尤为突出，其患病率是对照组的5.6 倍，且SLE 患者早期动脉粥样硬化与慢性炎症相关。NIESSNER 等［9］采用TLR9配体CpG 诱导动脉粥样硬化斑块pDC 释放IFN-α，发现IFN-α 可通过上调斑块处髓系树突状细胞与巨噬细胞TLR4 表达，使TNF-α、IL-12 和基质金属蛋白酶9等细胞因子产量升高，介导组织损伤，打破斑块稳定性，发挥炎症放大器作用。这说明是远处的病毒感染或组织损伤，同样可通过pDC-TLR7/9-IFN-α途径增加动脉粥样硬化斑块破裂的风险，甚至造成血栓形成、发生急性梗死。2015 年CLEMENT 等［10］利用多色流式细胞术发现表达CXCR3+外周血CD4+T 细胞频率与SLE 患者颈内动脉壁厚度呈正相关，首次证实T 细胞、NK 细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、髓系树突状细胞、pDC 及B 细胞中，pDC 是TLR9刺激后IFN-α的主要来源。同时CLEMENT等［10］利用载脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）小鼠模型，证实来源于pDC的IFN-α诱导冠状动脉内皮细胞产生CXCR3 配体，并促进CD4+CXCR3+T 细胞增殖、迁徙入动脉壁，导致动脉粥样硬化进展，表明pDC-TLR9-IFN-α通路可加快SLE 患者动脉粥样硬化发展。GENG 等［11］于2018 年发现相较于单基因敲除及野生型小鼠，载脂蛋白E 缺陷与FasL 缺陷（gld.）的双基因敲除C57BL/6 小鼠（gld. ApoE-/-小鼠）正常饮食条件下表现出狼疮样疾病加重与动脉粥样硬化加速，体内外实验证实，通过激活TLR7/9 信号通路过度表达的Ⅰ型IFN 可能通过抑制gld.ApoE-/-小鼠内皮祖细胞数量或功能加速动脉粥样硬化发展。

1.3 TLR7/9-IFN通路与狼疮小鼠模型

1.3.1 自发性狼疮鼠模型 2006 年PATOLE 等［12］发现5 周龄健康自发性狼疮模型MRLlpr/lpr 小鼠除TLR3外，其他TLR mRNA肾脏表达较脾脏低，20周龄肾炎性MRLlpr/lpr 小鼠肾脏TLR1-9 mRNA 表达上调，以上结果提示免疫复合物肾小球肾炎加重可能与TLRs 特异性表达有关。同年PAWAR 等［13］通过肾炎性MRLlpr/lpr 小鼠肾脏切片免疫染色发现TLR7在浸润ERHR3阳性巨噬细胞及少量CD11c阳性树突状细胞中表达，肾小球系膜细胞无表达，且体内外实验证实，TLR7 激动剂可诱导MRLlpr/lpr 小鼠单核细胞与树突状细胞分泌IFN-α、IL-12p70 等细胞因子并加重16～18 周龄MRLlpr/lpr 小鼠狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）。CHRISTENEN 等［14］发现TLR9 缺失时狼疮易感小鼠病情加重，淋巴细胞与pDC激活，血清IgG与IFN-α水平升高，相反TLR7基因缺陷小鼠病情有所改善。

1.3.2 诱导性狼疮鼠模型 降植烷（TPMD）诱导的SLE 小鼠模型适合研究人类SLE 与IFN 相关发病机制，其肾脏疾病与自身抗体的产生严格依赖于Ⅰ型IFN 受体信号传递，Ⅰ型IFN 主要来源于高表达Ly6C 的未成熟单核细胞，其产生完全由TLR7-MyD88 信号介导［15］。2016 年，BOSSALLER 等［16］分别为野生型与TLR9-/-BALB/c 小鼠注射磷酸盐缓冲液（PBS）或TMPD 后比较肾组织切片，发现TPMD+-TLR9-/-BALB/c 表现出更严重的肾小球肾炎，伴有新月体形成及硬化，且存活率最低；TPMD+-野生型BALB/c 肾脏病变较轻；PBS 组小鼠均未出现任何肾脏病变迹象，说明TLR9表达在TMPD诱导的BALB/c小鼠自身免疫中起保护作用。分别给BALB/c 野生型、TLR9-/-及TLR7-/-小鼠腹腔注射PBS、TMPD，分析第4 天腹膜细胞，发现与注射TMPD 的野生型或TLR7-/-小鼠相比，TMPD+-Tlr9-/-组Ly6Chi炎症性单核细胞数量显著升高且TLR7 与ISG 高表达。说明TLR7驱动的SLE模型中，TLR9起负向调控作用。

这些发现揭示尽管有产生IFN 的共同信号通路，但TLR7 与TLR9 可能存在反作用，TLR9 似乎在SLE 小鼠模型疾病发展过程中起保护作用，具体机制值得进一步探索，因此精准TLR 靶向药研发有远大前景。

2 miRNA 调控TLR7/9-IFN 通路在SLE发病机制作用

PARADOWSKA-GORYCKA 等［17］在2020 年 的一项研究中首次比较混合性结缔组织病、SLE、系统性硬化症患者全血TLR3/7/8/9与IFN-α/β/γ表达谱，发现仅SLE 患者表达IFN-γ、TLR3 及TLR8，SLE 患者TLR7、IFN-α 及IFN-β 表达为三种患者中最高，且亦存在TLR9 表达。这些结果再次证实TLR-IFN 途径在SLE发病机制中有区别于其他自身免疫性疾病的独特地位。健康人和SLE患者部分TLR通路相关miRNAs 存在差异性表达，如miR-155、miR-146a、miR-21［18-20］。本文将进一步阐述这几种miRNAs 与SLE TLR7/9-IFN信号通路的关系。

2.1 miR-146a

2.1.1 miR-146a 可通过调节TLR7/9-IFN 通路参与SLE 发病 KARRICH 等［21］研究表明pDC 经TLR7/9刺激后表达miR-146a，miR-146a可通过下调Bcl2-A1，与靶向髓样分化因子88（myeloid differentiation pri⁃mary response gene 88，MyD88）/TNF 受体相关因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）6/IL 受体相关激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）1 信号通路，共同调控pDC 存活、成熟及表达Ⅰ型IFN。崔慧娟等［22］研究发现，SLE 患者外周血miR-146a 表达下调，使其对靶基因TRAF6/IRAK1 的负调控作用减弱，导致TRAF6/IRAK1 mRNA 表达上调，引起下游Ⅰ型IFN 产生，而过度活化的Ⅰ型IFN 通路在SLE发生发展中发挥作用。2017年，WU 等［23］证实LN 肾组织miRNA-146a 可直接靶向并负向调控TRAF6 表达。ZHU 等［19］检测128 例LN 患者与30 例健康对照者PBMC miR-146a 及其靶基因TRAF6 表达，发现miR-146a 与TRAF6 对LN 有诊断价值，其AUC 分别为0.821 和0.897，生存曲线提示miR-146a 降低与TRAF6 上调可加快LN 终末期肾病进展并提升其1年内复发的可能性。

2.1.2 miR-146a 在SLE 中有调控IFN 通路下游途径的作用 TANG 等［24］采用TaqMan PCR 检测47 例SLE 患者血液样本白细胞miR-146a 表达，结果表明SLE 患者miR-146a 表达显著低于对照组，且与SLE疾病活动性呈负相关。进一步研究显示过表达miRNA-146a 可靶向TLR 信号通路关键级联蛋白IRF（IFN-regulatory factor）-5 与STAT（signal trans⁃ducer and activator of transcription）-1，下调狼疮患者ISG 表达，对Ⅰ型IFN 通路起负向调节作用。而SLEⅠ型IFN 亦可抑制miRNA-146a 成熟，导致SLE 炎症持续发展并上调其炎症基因表达［25］。

以上研究表明miR-146a 可能参与SLE 多系统发病机制，有作为疾病活动性指标及诊断生物标志物的潜力，也可将通过调节TLR7/9-IFN 信号通路及其下游信号途径作为治疗SLE的潜在靶点。目前已有学者尝试开发miRNA 疗法。PAN 等［26］应用大肠杆菌表达系统制备含miR-146a 的噬菌体MS2 病毒样颗粒（virus-like particles，VLP），将其注入BXSB 狼疮易感小鼠体内，发现MS2-miR146a VLP 疗法致自身抗体、总IgG及包括IFN-α在内的促炎细胞因子表达显著下调。

2.2 miR-155 miRNA 生成过程中，通常miRNA 前体（pre-miRNAs）进入细胞质后被核酸内切酶Dicer加工成双链miR-miR*，随后分离为成熟的前导链miRNA 与过客链miRNA*［27］。ZHOU 等［28］首次证实miRNA 及其伴侣miRNA*在同一生理过程中的合作效应。应用TLR7 刺激从健康人PBMC 中提纯的pDC，发现其可通过JNK 途径显著诱导miR-155 及其伴侣miR*-155 表达。进一步研究发现miR-155*通过靶向TLR 通路负向调控因子IRAKM 促进IFNα/β 产 生，随 后miR-155 通 过 靶 向TAB2 抑 制IFNα/β 产生，二者合作发挥对TLR7-Ⅰ型IFN 通路的动态微调作用。TANG等［29］证实MyD88是miR-155的靶基因。CHARRIERD 等［30］2012 年发现人脐血pDCsTLR9-MyD88/IRAK1/IRF7 通路转录后被高表达的miR-146a 与miR-155 抑制，降低了IFN 产量。以上研究说明miR-155 可通过多靶点发挥调控TLR7/9-IFN信号通路的作用。

KAGA 等［31］2015 年发现与健康人相比，未治疗的SLE 患者PBMC IFN-α 表达上调，且与显著下调的miR-155、miR-17 及miR-181b 表达呈负相关，提示miR-155 可能通过抑制IFN-α 表达参与SLE 发生发展。关于SLE miR-155与TLR7/9-IFN 信号通路的关系仍需深入研究。

2.3 外泌体miR-21

2.3.1 SLE 外泌体miR-21 可能有病理作用 外泌体是一种细胞外囊泡（EVs），因其有传递核酸、蛋白等生物活性物质，进而沟通细胞间通讯的特殊作用，成为近年来肿瘤及自身免疫性疾病的研究热点［32-33］。2019 年TANGTANATAKUL 等［34］发现活动期LN 患者尿液外泌体miR-21 表达显著下调，且与蛋白丢失及肾小球滤过率呈负相关。同年SOLÉ等［35］发现LN 尿液外泌体miR-21、miR-150、miR-29c表达与肾脏纤维化指数呈正相关。这些研究可提供一种部分替代肾穿刺的LN 疾病进展预测方法及早期肾纤维化无创检验方法。2020 年LI 等［20］分离38例SLE患者与18例健康对照者的血清外泌体，采用RT-qPCR检测发现血清外泌体miR-21表达上调，与蛋白尿呈正相关、与抗SSA/Ro抗体呈负相关。以上研究表明外泌体miR-21存在于多种体液中，有可能作为监测SLE疾病活动度、指导LN临床分期的标志物。

2.3.2 外泌体miR-21 可通过激活TLR7-IFN 通路参与SLE发病 CHEN等［36］证实miR-21可在转录后负向调控TLR信号通路MyD88与IRAK1，抑制IFN-α产生。2017 年YOUNG 等［37］发现SLE 存在一种新的固有炎症信号通路，EVs包裹的miR-21可作为TLR8的内源性配体诱导细胞因子表达。以上结果说明miR-21 不仅可在转录后调节TLR，亦可作为TLR 配体发挥作用。SALVI 等［38］在2018 年的一项研究进一步证实了这一点，其采用超速离心与密度梯度离心法从SLE 患者血浆中提纯外泌体，发现可诱导人pDC 产生Ⅰ型IFN。将包含miR-21 在内的含IFN 诱导基序（IFN induction motif，IIM）的miRNA利用脂质体转染至pDC，可使IFN 大量产生，且诱导IRF7（使Ⅰ型IFN 产生的主要转录因子）发生核转位。免疫荧光法发现这种IIM mRNA 定位于早期内体，且以剂量依赖方式减少TLR7 配体R848 诱导的IFN-α产量。

以上研究结果表明SLE miRNA数量异常且部分miRNAs 功能异常。外泌体miR-21可作为分泌型炎症介质参与外泌体细胞间通讯过程，通过激活TLR7大量表达IFN，参与SLE病理过程。提示靶向miR-21及任何可能作为TLR 配体的miRNA 是抑制SLE 炎症的一种新治疗策略。未来可应用小鼠模型进一步验证miR-21病理机制。

2.4 其 他miRNAs DENG 等［39］发 现 白 种 人SLE PBMC miR-3148 与TLR7 mRNA 水平呈负相关。rs3853839 是TLR7-TLR8 区域内唯一显示与SLE 一致且独立关联的SNP，其G 等位基因及转录本表达上调与SLE 发病风险升高相关，而miR-3148 下调导致风险G等位基因降解较慢，引起TLR7 mRNA水平升高。KAGA 等［31］发现SLE 患者PBMC IFN-α 表达上调，miR-181b 显著下调，二者呈负相关，萤光素酶基因分析显示miR-181b可靶向IFN-α。以上研究说明miRNA 可通过调节TLR7/9-IFN 通路多个关键分子在SLE中发挥病理作用。

3 结语

综上所述，尽管目前SLE发病机制不明确，但越来越多的研究证实miRNA 在SLE 发病机制中的重要性。miRNA 可对TLR7/9 分子本身及TLR7/9-IFN通路关键信号级联分子进行转录后水平调控，亦可作为TLR 配体直接激活信号通路。未来的研究需进一步探讨SLE、miRNA 及TLR7/9-IFN 通路三者间联系，挖掘miRNA 在预测疾病进展、早期诊断、疾病活动性评价方面作为标志物与治疗靶点的潜力。