FOXP3 基因沉默抑制肺腺癌A549 细胞上皮-间质转化和改善5-氟尿嘧啶耐药性①

历 春 王鹤霏 何程远 房 惠 裴怡杰 盖晓东

（北华大学基础医学院免疫学教研室，吉林 132013）

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其五年生存率不超过17%［1-2］。目前，肺腺癌的发病率逐年上升，已超过肺鳞癌成为肺癌中最常见的组织学类型［3］。多数患者就诊时已属中晚期，尽管采用手术、放疗和化疗等综合治疗措施，肿瘤复发、转移和对化疗药物不敏感是影响临床治疗和预后的主要因素［4］。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）是上皮细胞失去极性转变成具有迁移能力的间质细胞，主要表现为上皮细胞标志分子E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下调，间质细胞标志分子波形蛋白（Vimentin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达上调，也是肺腺癌发生转移的关键步骤［5-6］。此外，EMT 在肿瘤耐药中也发挥重要作用，肿瘤细胞可通过获得间质细胞表型产生对化疗药物的耐药［7］。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是目前临床上广泛应用的化疗药物，其可通过干扰核酸的合成而抑制肿瘤细胞的增生，还可抑制肿瘤细胞EMT，多与其他化疗药物联合应用治疗肺腺癌［8-9］。研究发现，超过50%以上的肺腺癌细胞具有间质表型，且与转移和复发呈正相关［10-11］。因此，逆转EMT 是有效治疗肺腺癌、改善预后的关键环节。

叉头蛋白3（forkhead box protein 3，FOXP3）是调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）的特异性标志物，可通过发挥免疫抑制功能参与肿瘤免疫逃逸［12］。近年研究发现，FOXP3 在多种肿瘤细胞高表达，可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，其表达水平与患者预后呈负相关［13-15］。课题组前期工作发现，FOXP3 在肺腺癌细胞高表达，具有促进细胞增殖、淋巴结转移等恶性生物学行为，并可降低顺铂和阿霉素的敏感性，但其在EMT 和5-FU 耐药性中的作用尚未阐明［16-18］。因此，本研究通过RNAi 技术抑制FOXP3 在肺腺癌A549 细胞株中的表达，旨在明确FOXP3 与EMT 和5-FU 耐药的关系，拟为肺腺癌的免疫治疗提供潜在的分子靶点，有望改善肺腺癌患者的预后。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌A549细胞株购自中国科学院上海细胞库；DMEM 培养基购自美国Hyclone 公司；新生牛血清购自天杭生物科技股份有限公司；FOXP3 siRNA 序列及阴性对照序列由广州锐博生物技术有限公司合成；LipofectaminTM2000 试剂盒购自 赛 默 飞 世 尔；TRIzol，PrimeScriptTMRT 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa 公司；PCR 引物由生工生物工程有限公司合成；基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9 ELISA 试剂盒、FOXP3 抗体购自武汉博士得生物工程有限公司；Transwell 小室购自美国Corning公司；Matrigel 胶购自美国BD公司；RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、ECL 发光试剂盒、CCK-8 试剂盒以及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和GAPDH 抗体购自碧云天生物技术有限公司；5-FU 购自上海旭东海普药业有限公司；P-糖蛋白（P-gp）抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人肺腺癌A549细胞株培养于含10%新生牛血清的高糖DMEM 培养基中，置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的孵箱中常规培养。

1.2.2 细胞转染与5-FU 处理细胞 选取第3 代细胞以2.5×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后进行siRNA转染。转染实验分为3组：阴性对照组（si-NC）、si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 组。si-FOXP3-1引物序列：5'-CAUGGACUACUUCAAGUUCdTdT-3'；si-FOXP3-2 引 物 序 列：5'-GAGAGAUGGUACAGU⁃CUCUdTdT-3'。转染步骤参照LipofectamineTM2000说明进行，分别于转染后6 h 更换为含血清的DMEM培养基。

选取第3 代细胞以5×105个/孔的密度接种于6 孔板，待细胞贴壁后加入12.5 μg/ml 的5-FU 作为5-FU 处理组，0 μg/ml 的5-FU 作为未处理组，48 h 收集细胞进行检测。

1.2.3 qRT-PCR 实验 收集转染48 h及5-FU 处理48 h 的各组细胞，TRIzol 裂解法提取总RNA，用PrimeScripTMRT 试剂盒逆转录合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行实时PCR，条件如下：95 ℃15 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s 退火，40 个循环。FOXP3引物序列F：5′-CACAACATGCGACCCCTTTCACC-3′，R：5′-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3′；GAPDH 引物序列F：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，R：5′-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3′。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA含量。

1.2.4 Western blot 实验 收集转染72 h 及5-FU处理48 h 的各组细胞，提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，每孔加入30 μg 蛋白，行10%SDS-PAGE 电泳，湿转方式移至PVDF 膜，5%BSA 室温下封闭1 h。分别滴加一抗FOXP3（1∶300）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、P-gp（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）于4 ℃过夜。TBST 冲洗后室温孵育HRP标记的IgG抗体（1∶2 000）1 h，加入ECL显色底物发光并拍照。以GAPDH作为内参，以目标条带与内参照条带的灰度值比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.2.5 Transwell小室迁移和侵袭实验 取转染48 h的各组细胞，用无血清培养基调整密度为5×105个/ml。迁移实验：取100 μl 加入Transwell 上室，下室中加入500 μl 含10%血清的DMEM 培养基。20 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，苏木素染色5 min，水洗后用棉签轻轻拭去Transwell 小室上层未迁移的细胞，200 倍显微镜下随机5 个视野观察细胞并计数。侵袭实验：用预冷的无血清DMEM 培养基以1∶8 稀释Matrigel，各组上室加入80 μl，置37 ℃孵箱2 h。其余步骤同迁移实验。

1.2.6 ELISA 实验 取转染72 h 的各组细胞培养上清各1 ml，2 000 r/min 离心10 min，按照MMP-2 和MMP-9 ELISA 说明书步骤严格操作。全自动酶标分析仪检测450 nm 处的吸光度（OD）值，依标准品值制作标准曲线，计算MMP-2和MMP-9蛋白含量。

1.2.7 CCK-8 实验 取转染24 h 的各组细胞，5×103个/孔、100 μl 培养基接种于96孔板，贴壁后分别加入不同浓度的5-FU（0、3.125、6.25、12.5、25和50 μg/ml），每个浓度设置6个复孔，并设置空白对照。48 h后10 μl/孔加入CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。酶标分析仪在450 nm 波长处测量各孔OD 值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（对照组平均OD 值-给药组平均OD 值）/对照组OD 值×100%，并进一步用SPSS 统计软件计算细胞生长抑制50%的药物浓度（IC50）。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0 统计软件分析，实验数据以±s表示，两组间差异比较采用配对t检验，多组差异比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。所有实验重复3次。

2 结果

2.1 转染si-FOXP3后各组细胞FOXP3表达情况为验证FOXP3 siRNAs 转染A549 细胞的效果，采用qRT-PCR 和Western blot 方 法，分 别 在 转 染48 h 和72 h 检测各组细胞中FOXP3 的表达。结果显示，与si-NC 组 相 比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 组FOXP3 mRNA 和蛋白表达均显著降低（P<0.01），见图1。结果提示成功沉默A549细胞中FOXP3的表达。

图1 转染si-FOXP3后A549细胞FOXP3表达Fig.1 Expressions of FOXP3 in A549 cells transfected with si-FOXP3

2.2 FOXP3 沉默对EMT 的影响 为明确FOXP3与EMT 之间的联系，采用Western blot 实验检测FOXP3沉默后各组细胞EMT 相关标志物表达，包括间质标志物Vimentin、N-cadherin 和上皮标志物E-cadherin。结果显示，与si-NC 组相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2组Vimentin 和N-cadherin 蛋白表达均显著降低（P<0.01），E-cadherin 蛋白表达均显著升高（P<0.01），见图2。结果表明，FOXP3沉默可抑制A549细胞EMT。

图2 FOXP3 沉 默 对Vimentin、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表达的影响Fig.2 Effects of FOXP3 silencing on protein expressions of Vimentin，N-cadherin and E-cadherin

2.3 FOXP3 沉默对细胞迁移和侵袭的影响 为明确FOXP3 在EMT 中的具体作用，Transwell 迁移和侵袭实验检测FOXP3 沉默后各组细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 组跨膜和穿过基质胶的细胞数与si-NC 组相比均显著减少（P<0.01），见图3。结果表明，FOXP3沉默可显著降低A549细胞的迁移和侵袭能力。

图3 FOXP3沉默对A549细胞迁移和侵袭能力的影响（×400）Fig.3 Effects of FOXP3 silencing on migration and invasion abilities of A549 cells（×400）

2.4 FOXP3 沉默对MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影响 为探讨FOXP3 促进A549 细胞迁移和侵袭的相关分子机制，ELISA 实验检测FOXP3 沉默后各组细胞上清中MMP-2和MMP-9的表达。结果显示：与si-NC 组相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2组细胞上清中MMP-2和MMP-9蛋白含量均显著降低（P<0.01），见图4。结果表明，FOXP3 沉默可通过抑制MMP-2和MMP-9 表达进而降低A549 细胞的迁移和侵袭能力。

图4 FOXP3沉默对MMP-2和MMP-9蛋白含量的影响Fig.4 Effects of FOXP3 silencing on protein concentra⁃tions of MMP-2 and MMP-9

2.5 5-FU 作用于A549 细胞对FOXP3 表达的影响 为探讨FOXP3 与5-FU 耐药性之间的联系，收集5-FU（12.5 μg/ml）处理48 h 的A549 细胞，qRTPCR 和Western blot 实验分别检测FOXP3 的表达。结果显示：5-FU处理组FOXP3 mRNA 和蛋白均显著高于未处理组（P<0.05），见图5。结果表明，5-FU作用A549 细胞可上调FOXP3 表达，提示FOXP3 可能参与5-FU诱导的耐药作用。

图5 5-FU作用的A549细胞FOXP3表达Fig.5 FOXP3 expression in 5-FU treated A549 cells

2.6 FOXP3 沉默对5-FU 敏感性的影响 为明确FOXP3 在5-FU 耐药中的作用，选用不同浓度的5-FU 作用于各组细胞，CCK-8 法检测各组细胞活性，计算细胞增殖抑制率和IC50值。与si-NC 组比较，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 组细胞增殖抑制率均显著增加，在6.25、12.5、25 和50 μg/ml 浓度时差异显著（P<0.05），IC50值也明显降低。结果表明，FOXP3 沉默可显著增加A549 细胞对5-FU 的敏感性，见表1。

表1 FOXP3沉默对A549细胞5-FU耐药性的影响（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

表1 FOXP3沉默对A549细胞5-FU耐药性的影响（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

IC50/（μg·ml-1）13.90 8.52 9.09 Groups si-NC si-FOXP3-1 si-FOXP3-2 Inhibition rate of various concentrations of 5-FU/%3.125/（μg·ml-1）27.7±1.76 32.6±2.08 31.7±1.51 6.250/（μg·ml-1）33.9±2.12 43.4±1.621）41.5±2.051）12.500/（μg·ml-1）45.1±1.45 54.5±1.571）53.7±2.201）25.000/（μg·ml-1）61.7±3.61 72.8±2.561）71.7±2.511）50.000/（μg·ml-1）72.5±2.50 79.1±3.121）78.5±3.551）

2.7 FOXP3 沉默对P-gp 表达的影响 为探讨FOXP3 促进5-FU 耐药的分子机制，Western blot 实验检测FOXP3 沉默后各组细胞中P-gp 的表达。结果显示，与si-NC 组相比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2组P-gp 表达水平均显著降低（P<0.01），见图6。结果提示，FOXP3 沉默可通过抑制A549 细胞P-gp 表达进而影响5-FU的耐药性。

图6 FOXP3沉默对P-gp表达的影响Fig.6 Effects of FOXP3 silencing on P-gp expression in A549 cells

3 讨论

研究报道，FOXP3 可促进肺腺癌细胞的增殖，可通过上调细胞周期蛋白表达诱导细胞从G1期向S 期转化从而调控细胞的生长［19］。本课题组前期报道，FOXP3 在肺腺癌细胞的表达与淋巴结转移及TNM 分期呈正相关，还可通过抑制免疫抑制因子IL-10 和TGF-β 的分泌抑制T 淋巴细胞增殖，表明FOXP3 与肺腺癌侵袭和转移关系密切，但其作用的相关机制尚未完全阐明［16-17，20］。

EMT 是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要环节，是肿瘤细胞摆脱细胞间黏附和突破细胞外基质（extra⁃cellar matrix，ECM）获得迁移和侵袭能力的动态过程［21］。临床研究发现，具有EMT 表型的肺腺癌细胞，其侵袭性和转移能力更强［10-11］。因此，本研究通过RNA 干扰（RNAi）技术沉默人肺腺癌细胞FOXP3基因的表达，探究其在EMT 过程中的作用。本课题组发现，FOXP3 表达下调可显著增强上皮细胞标志E-cadherin 表达，抑制间质细胞标志Vimentin 和N-cadherin 表达，表明FOXP3 基因沉默可逆转肺腺癌细胞EMT 表型。Transwell 小室迁移和侵袭实验进一步证实FOXP3 在促进肺腺癌细胞迁移和侵袭过程中的重要作用。LIU等［22］探究FOXP3在宫颈癌侵袭的作用中发现，FOXP3 沉默可显著抑制宫颈癌细胞的侵袭能力、并上调E-cadherin和下调Vimentin的表达，表明FOXP3可通过EMT促进宫颈癌细胞的侵袭，与本研究中的结果一致。ECM 和基底膜的降解是EMT 过程的关键步骤，MMP-2 和MMP-9 是降解ECM 和基底膜最主要的基质金属蛋白酶，在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用［23］。本研究发现肺腺癌细胞FOXP3 基因沉默后MMP-2 和MMP-9 表达显著降低，表明FOXP3可能通过调控MMP-2和MMP-9的表达促进ECM 降解，进而增强肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力，参与EMT过程。

临床上，5-FU 多与阿霉素等化疗药物联合应用治疗肺腺癌［9］。本课题组前期工作发现，FOXP3 可降低阿霉素和顺铂的敏感性［17-18］。另有研究报道5-FU 可通过抑制肿瘤细胞EMT 发挥抗肿瘤作用［8］。结合本研究结果FOXP3可促进肺腺癌细胞EMT，推测FOXP3 可能与5-FU 耐药有关联。实验结果证实了本研究的推测，FOXP3的表达在5-FU处理肺腺癌细胞后显著上调，表明5-FU 的耐药作用可能与FOXP3 的表达水平有关。为明确FOXP3 在5-FU 耐药中的具体作用，本研究通过细胞毒实验检测FOXP3基因沉默后5-FU对肺腺癌细胞的杀伤效果。结果发现FOXP3表达下调后，5-FU作用下的细胞抑制率显著增加，IC50也明显降低，提示抑制FOXP3 表达可改善肺腺癌细胞对5-FU 的耐药性。化疗耐药的主导机制之一是细胞膜转运蛋白表达增加从而导致化疗药物的外排［24-25］。P-gp 具有ATP 依赖的药物外排泵功能，能将进入细胞内的药物泵出细胞外，从而降低细胞内的药物浓度［26］。本研究发现FOXP3 基因沉默可显著抑制P-gp 表达，提示FOXP3可能通过调控P-gp表达增加5-FU外排导致耐药。

综上所述，FOXP3 基因沉默可以抑制肺腺癌细胞EMT，改善肺腺癌细胞对5-FU的耐药性。本研究结果为阻断肺腺癌的侵袭、转移以及改善肺腺癌的耐药提供新的研究思路。