利多卡因通过PI3K/Akt途径抑制人口腔癌细胞HN13增殖并促进其凋亡①

常冰梅 肖瑞琳 赵 虹 杨小庆 张 栋 王丽丽

（山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，太原 030001）

口腔癌是指发生于口腔的恶性肿瘤，其病理分型以鳞状细胞癌最为多见，按发生部位分为舌癌、牙龈癌、颊癌、腭癌、上下颌骨癌、唇癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤的癌症［1-2］。口腔癌为头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占全身恶性肿瘤发病率的5%，我国口腔癌发病率为3.6/10 万～8.0/10 万，已居全身恶性肿瘤发病率第10 位［3］。口腔癌具有病程进展快、肿瘤浸润广、预后差等特点，对人类生命健康造成极大威胁。

近年局部麻醉药抗肿瘤的作用及机制逐渐受到重视。已有研究表明，局部麻醉药能够影响部分肿瘤细胞凋亡、增殖、转移、癌基因表观修饰等行为［4-5］。临床上利多卡因和其他局部麻醉剂可用于缓解肿瘤患者来自口腔或直肠的癌症疼痛，目前认为其在口腔使用局部麻醉剂缓解癌痛的同时可抑制口腔癌细胞扩散，其机制可能为利多卡因通过抑制酪氨酸激酶受体EGFR 活性途径抑制凋亡［6］。但不同局部麻醉药对不同恶性肿瘤的抗肿瘤作用效果有所不同。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt 信号通路对细胞增殖、分化、凋亡都起着关键的调控作用，大量数据表明该通路在多种肿瘤细胞中呈过度激活状态，且与肿瘤发生、发展、预后密切相关［7］。基于此，本文就利多卡因在抑制人口腔鳞癌细胞增殖及机制方面进行了进一步研究，以期为利多卡因在口腔肿瘤的应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人口腔鳞细胞HN13（Cellbio 公司）；DMEM 细胞培养液（Gibco 公司）；10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司）；顺铂注射液（云南植物药业有限公司）；利多卡因注射液（四环药业）；FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒（Invitrogen公司）；CCK-8 试剂盒（碧云天生物技术研究所）；兔抗人p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、GAPDH一抗（Cell Signaling公司）；过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 及eECL 高灵敏度化学发光试剂盒（博士德生物公司）；GELDOC XR凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 采用DMEM 培养基培养癌细胞株HN13，其中含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉 素、100 U/ml 链 霉 素，pH=7.2～7.4，于5%CO2、37 ℃、90%相对湿度下培养。每2 d 换液1 次，保持细胞正常生长，常规消化传代。

1.2.2 细胞分组 取对数生长期细胞1×105个/ml，接种于细胞培养瓶。参照文献和细胞学预实验结果选取药物浓度及分组，实验细胞分为5组：①阴性对照组（NC），以无血清DMEM为对照；②阳性对照组（PC）：终浓度100 μmol/L 顺铂；③低浓度组：终浓度40 μmol/L利多卡因；④中浓度组：终浓度400 μmol/L利多卡因；⑤高浓度组：终浓度4 000 μmol/L 利多卡因。以上各组均在无血清培养液中继续培养6 h［8-9］。

1.2.3 不同浓度利多卡因对细胞增殖的影响 各组细胞处理6 h 后，常规消化细胞，显微镜下计数，按照1×104个/100 μl 将细胞接种于96 孔板。加入DMDM 培养液，10%胎牛血清，37 ℃、5%CO2、饱和湿度下培养。细胞培养48 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液至96 孔板，细胞培养箱内继续孵育2 h，于入射光波长450 nm处测定吸光度，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 按1.2.3 方法培养的各组细胞置于细胞培养箱培养48 h，PBS冲洗细胞2次，再将细胞消化成单细胞悬液，收集至10 ml 离心管中，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。将细胞重悬于200 μl Binding Buffer。加入10 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI，充分混匀，避光室温反应15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 检 测p-PI3K、p-Akt，Bcl-2 表达 将1.2.3培养的各组细胞置于细胞培养箱继续培养48 h 后分别收集细胞，提取细胞总蛋白，以GAPDH为内参。BCA定量分别得出样品蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，调整蛋白上样浓度一致，行SDS-PAGE 电泳（110 V，2 h），随后按1.5 A/cm2选择恒流半干式转膜2～2.5 h。将PVDF 膜浸泡在含5%脱脂奶粉的TBST 中，小摇床中封闭1 h 后，加一抗4 ℃孵育过夜，按说明书比例室温孵育二抗2 h，随后用凝胶成像仪进行发光并记录灰度值，蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2 结果

2.1 不同浓度利多卡因对细胞增殖的影响 随着利多卡因药物浓度增大，细胞OD 值呈下降趋势，与对照组相比，利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L 处理组差异具有统计学意义（P<0.05），利多卡因40 μmol/L处理组与对照组相比差异无统计学意义，与顺铂组相比差异具有统计学意义（P<0.05，图1）。利多卡因中、高浓度组细胞增殖能力降低。

图1 不同浓度利多卡因作用下细胞A值变化Fig.1 Absorbtance value changes of cells in different doses of lidocaine groups

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 为进一步检测利多卡因对细胞凋亡的作用效果，采用流式细胞术对其进行具体分析。利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L处理组与对照组相比凋亡率升高（P<0.05）；利多卡因40 μmol/L、400 μmol/L 处理组与顺铂组相比差异具有统计学意义（P<0.05，表1、图2）。

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡Fig.2 Detection of cell apoptosis by FCM

表1 各组细胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

表1 各组细胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with PC group，2）P<0.05.

Apoptosis rate/%9.63±1.52 42.51±1.18 11.35±2.022）17.00±2.021）2）38.25±1.181）Groups NC PC Lidocaine low dose（40 μmol/L）Lidocaine medium dose（400 μmol/L）Lidocaine high dose（4 000 μmol/L）

2.3 不同剂量利多卡因对蛋白表达影响 采用Western blot 检测各组细胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 蛋白表达变化，与对照组相比，利多卡因低、中、高剂量组p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表达降低（P<0.05），且呈剂量依赖性（P<0.05）。利多卡因低、中剂量组p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表达高于顺铂组（P<0.05）；利多卡因高剂量组p-Akt 表达高于顺铂组（P<0.05）；利多卡因高剂量组p-PI3K、Bcl-2表达与顺铂组相比差异无统计学意义（P>0.05），见图3。

图3 不同剂量利多卡因对蛋白表达影响Fig.3 Effects of different doses of lidocaine on proteins expressions

3 讨论

利多卡因属于经典的酰胺类麻醉药，临床常用于黏膜麻醉、局部皮肤及区域神经阻滞，并有抗炎、抗菌等特殊作用［10-11］。在口腔科各类诊疗技术中应用非常普遍，主要用于牙体牙髓病、龈下刮治术、三叉神经痛等封闭麻醉以及与其他药物组成复方用于口腔溃疡、口腔黏膜炎、口腔单纯疱疹治疗，疗效显著［12-13］。近年随着肿瘤发病机制研究不断深入，研究者逐渐认识到围术期应用不同麻醉药物对肿瘤转移、复发、生存期也存在一定影响，且发现利多卡因这一低细胞毒性、传统的经济药物在肿瘤治疗、预防方面具有较好的应用前景［14］。

肿瘤细胞增殖失控是导致肿瘤患者病程进展恶化的主要原因，严重威胁肿瘤患者生命。抑制肿瘤细胞迅速增殖是一种有效的抗肿瘤方式，日本学者SAKAGUCHI 等［6］发现利多卡因可抑制人类舌癌细胞株CA127 增殖。该项研究采用利多卡因处理高表达表皮生长因子受体的人舌癌细胞株CA127，证实利多卡因通过抑制EGFR 酪氨酸激酶途径发挥抗人舌癌细胞增殖作用。本研究证实利多卡因对口腔鳞癌有增殖抑制作用，为局麻药利多卡因用于口腔肿瘤治疗提供了实验依据。

除抑制肿瘤细胞增殖外，促进肿瘤细胞凋亡也是治疗肿瘤的有效策略。目前研究证实利多卡因体外抗肿瘤作用可通过多种途径促进其凋亡［15］。以上诱导肿瘤细胞凋亡途径包括去内质网应激途径、甲基化途径、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径、类肝素结合样表皮生长因子（HB-EGF）途径以及其他非死亡受体途径等。其中PI3K/Akt 信号通路是一条重要的信号转导通路，在细胞中起抗凋亡、促进增殖、生存的重要调控作用。该通路在多种肿瘤细胞中均呈过度激活状态，其过度激活与肿瘤发生、发展、迁移密切相关。P13K 家族参与的众多信号转导途径中，P13K/Akt 信号转导途径在凋亡调节中发挥重要作用。

PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，当胞外信号与受体酪氨酸激酶或G 蛋白偶联受体结合后将PI3K 募集到细胞膜，激活PI3K，PI3K 后可磷酸化膜磷脂磷脂酰肌醇PI肌醇环的第3位碳原子参与多种PI 中间体磷酸化，如产生PIP3。PIP3 与细胞内含有PH 结 构 域 的 信 号 蛋 白PDK1（phosphoinositide de⁃pendent kinase-1）和Akt 结合，促使PDK1 磷酸化Akt而活化Akt。Akt又称PKB，属于丝氨酸/苏氨酸激酶是PI3K最重要的下游分子。Akt分子上有位于CAT（central kinase catalytic）结构域T308 和调节性疏水结构域的S473 2 个磷酸化位点，发生磷酸化后Akt被完全激活。激活后Akt转位到细胞浆或细胞核通过改变下游分子磷酸化水平调节细胞功能。PI3K活化的Akt能够作用于其下游关键的凋亡蛋白，如凋亡Bcl-2家族成员BAD、mTOR、eNOS、NF-κB、FOXO、MDM2、CREB、caspase-9 等下游底物分子，发挥其抗凋亡、促生存的生物学效应［16-18］。本研究证实利多卡因可通过抑制PI3K/Akt 途径，抑制Bcl-2 等抗凋亡蛋白表达发挥促进凋亡作用。细胞内的各种信号通路并不是单一存在的，而是相互交叉形成网络，PI3K/Akt仅是这些通路中的中心位点之一，还可被EGFR、ras、IRS1、JAK、FAK、c-met 等多种上游分子激活。利多卡因所表现出的抗肿瘤疗效仍是值得肯定的，所涉及的凋亡途径众多，有待进一步研究。

总之，常用药利多卡因在肿瘤外科并与化疗、放疗、生物治疗联合应用，在增效减毒、降低围手术期应激、减少多因素致肿瘤扩散等方面具有重要应用前景。近年关于在临床围术期应用利多卡因降低肿瘤复发率及总体死亡率多有报道，为传统麻醉药利多卡因用于肿瘤治疗提供了更多新的依据，但利多卡因在抗肿瘤方面涉及的分子机制有待深入研究［19-20］。