利多卡因通过miR-146b-5p调控胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的分子机制研究

吕艳玲，王冰

宝鸡市人民医院麻醉科，陕西 宝鸡 721000

利多卡因是临床常用的局部酰胺类麻醉剂，对急性或慢性疼痛疾病，如神经性疼痛、炎症和伤害性疼痛具有突出的疗效[1]。除此之外，利多卡因还具有显著的抗癌活性[2]。研究表明，利多卡因可以抑制胃癌[3]、肺癌[4]、膀胱癌[5]和卵巢癌[6]等癌症的生长和转移。利多卡因是一种有效的肿瘤抑制剂，但其对胃癌作用机制的研究有限。微小RNA(microRNA，miRNA)不仅是管理细胞生长和发育的关键调节器，并且在调节药物疗效和毒性方面也发挥着重要作用[7]。研究证实miR-146b-5p在胃癌细胞中表达上调，被认为是胃癌的诊断和预后生物标志物[8]。较高水平的miR-146b-5p 能促进胃癌细胞增殖和减轻凋亡[9]。由于miR-146b-5p 在胃癌的发病机制中起重要作用，因此深入研究miR-146b-5p 在利多卡因功效中扮演的角色十分必要。本研究旨在探讨利多卡因对胃癌细胞生物学行为的影响，以及其作用机制是否与miR-146b-5p 有关。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌细胞SNU-1(武汉普诺赛)，利多卡因(≥99.7%，100 mg；中国食品药品检定研究院)，anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p(上海Genepharma)，CCK-8 溶液(日本Dojindo)，BCA Protein Assay Kit(美国Pierce)，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔单克隆抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Cleaved Caspase-3)兔单克隆抗体、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloprotease，MMP2)兔单克隆抗体、MMP9 兔单克隆抗体(美国Abcam)，膜联蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI) (上海Sangon)，逆转录试剂盒(上海Toyobo)，SYBR Green实时PCR试剂盒(德国Roche Diagnostics)。

1.2 细胞培养 SNU-1细胞在青霉素(100 IU/mL)、含链霉素(100 μg/mL)和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，培养箱保持湿润、95%空气、5%CO2的环境，温度为37℃。

1.3 实验分组 实验共分为NC组、50 μmol/L利多卡因组、100 μmol/L利多卡因组、200 μmol/L利多卡因组、anti-miR-NC 组、anti-miR-146b-5p 组、miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组和miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因组8 组。其中，NC 组SNU-1 细胞未经任何处理，50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因组SNU-1 细胞以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因处理24 h[2]。anti-miR-NC组、anti-miR-146b-5p组、miR-NC+200 μmol/L利多卡因组和miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因组SNU-1 细胞分别按照Lipofectamine 2000 试剂操作指南转染anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p，转染48 h后，收集细胞或以200 μmol/L利多卡因处理24 h。

1.4 CCK-8 法检测细胞增殖 SNU-1 细胞重新接种到96孔板中(大约5×103个细胞/孔)。然后，将10 μL CCK-8 溶液加入到细胞中。细胞在由湿润、95%空气和5%CO2的环境中孵育1 h 后，通过酶标仪测定吸光度A值(450 nm)评估细胞增殖。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 SNU-1 细胞经不同处理后，接种到6孔板(大约1×105个细胞/孔)，用冷磷酸盐缓冲液洗涤，然后重悬于结合缓冲液中，将细胞在5 μL Annexin V-FITC 和PI 中避光染色15 min。根据FACS can 流式细胞仪的说明进行流式细胞术检测。凋亡结果通过FlowJo软件计算。

1.6 Transwell 检测细胞迁移及侵袭 细胞迁移测定通过Transwell 小室进行。上层填充有稀释于无血清培养基的SNU-1 细胞。下层补充有血清培养基。37℃孵育后，用甲醇固定细胞，将SNU-1 细胞用0.5%结晶紫染色10 min，计算迁移到膜下侧的细胞数。细胞侵袭测定与细胞迁移测定类似，但在细胞侵袭测定中，Transwell小室上层预先涂有基质胶。其余步骤与细胞迁移测定相同。

1.7 Western blot 检 测CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9 蛋白相对表达 通过使用蛋白提取试剂盒获得SNU-1 细胞中的蛋白质，采用BCA Protein Assay Kit计算蛋白浓度。等量的蛋白质(30 μg)在100℃下于上样缓冲液中变性15 min。将含有等量蛋白并在样品缓冲液中制备的样品加载到8%～12%SDS/PAGE 孔中，并通过电压梯度转移到PVDF 膜上。将膜在5%脱脂牛奶中封闭过夜，与抗CyclinD1、抗Cleaved Caspase-3、抗MMP2、抗MMP9、抗β-actin(内源性对照)一抗在4℃下轻摇过夜，与羊抗兔二抗孵育。显影后通过Image Lab软件估计不同的蛋白条带。

1.8 实时定量PCR 检测miR-146b-5p 表达 用TRIzol 试剂从不同处理SNU-1 细胞中提取总RNA。使用逆转录试剂盒和miRNA 特异性miRNA RT 引物从RNA样品中产生cDNA。U6 snRNA用作数据标准化的内源性对照。使用SYBR Green实时PCR试剂盒在ABI Prism 7500序列检测系统上进行实时PCR。使用2-ΔΔCt方法确定相对miR-146b-5p 表达。引物序列(5′-3′)为miR-146b-5p F：GGGCGGTGAGAACTGAATT，miR-146b-5p R：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6 R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 统计学方法 应用SPSS22.0 软件进行数据统计分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组数据间比较采用独立样本t检验，组间多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度利多卡因对SNU-1 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 不同浓度利多卡因处理SNU-1细胞后，与NC组比较，50 μmol/L利多卡因组、100 μmol/L利多卡因组、200 μmol/L利多卡因组细胞的增殖能力逐渐减弱，凋亡率逐渐增加，迁移和侵袭数量逐渐减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1和图1。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

表1 不同浓度利多卡因对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响(±s，n=9)

表1 不同浓度利多卡因对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响(±s，n=9)

注：与NC比较，aP＜0.05。

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2.2 不同浓度利多卡因对SNU-1 细胞中有关蛋白表达的影响 不同浓度利多卡因处理SNU-1细胞后，与NC 组比较，50 μmol/L 利多卡因组、100 μmol/L利多卡因组、200 μmol/L 利多卡因组细胞的CyclinD1蛋白、MMP2 蛋白和MMP9 蛋白的表达量逐渐降低，Cleaved Caspase-3 蛋白表达量逐渐增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2和图2。

图2 Western blot检测CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9蛋白相对表达

表2 不同浓度利多卡因对SNU-1细胞中有关蛋白表达的影响(±s，n=9)

表2 不同浓度利多卡因对SNU-1细胞中有关蛋白表达的影响(±s，n=9)

注：与NC比较，aP＜0.05。

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2.3 不同浓度利多卡因对miR-146b-5p表达的影响 50 μmol/L 利多卡因组、100 μmol/L 利多卡因组、200 μmol/L 利多卡因组SNU-1 细胞的miR-146b-5p表达量分别为0.86±0.08、0.61±0.07、0.47±0.04，均少于NC 组的1.00±0.09，差异均有统计学意义(F=98.114，P＜0.05)。

2.4 anti-miR-146b-5p 对SNU-1 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 转染anti-miR-146b-5p后，anti-miR-146b-5p 组SNU-1 细胞的miR-146b-5p和CyclinD1 蛋白的表达量比anti-miR-NC 组低，Cleaved Caspase-3 蛋白表达量比anti-miR-NC 组高，MMP2、MMP9 蛋白的表达量、增殖能力比anti-miR-NC 组低，凋亡率比anti-miR-NC 组高，且迁移和侵袭数量比anti-miR-NC 组低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3和图3。

图3 anti-miR-146b-5p上调对SNU-1细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

表3 anti-miR-146b-5p对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(±s，n=9)

表3 anti-miR-146b-5p对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(±s，n=9)

注：与anti-miR-NC比较，aP＜0.05。

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2.5 miR-146b-5p 可以逆转利多卡因对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因组SNU-1 细胞的miR-146b-5p、CyclinD1 蛋白的表达量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组，Cleaved Caspase-3 蛋白表达量低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组，MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组，凋亡率低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组，迁移和侵袭数量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4和图4。

图4 miR-146b-5p可以逆转利多卡因对SNU-1细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

表4 miR-146b-5p可以逆转利多卡因对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(±s，n=9)

表4 miR-146b-5p可以逆转利多卡因对SNU-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(±s，n=9)

注：1组，miR-NC+200 μmol/L利多卡因；2组，miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因；与1组比较，aP＜0.05。

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3 讨论

麻醉剂也可能影响癌症的进展。利多卡因是一种常用的局部麻醉剂，其抗癌作用被广泛报道。诸多研究揭示利多卡因不仅抑制癌细胞生长、加速细胞凋亡，还抑制细胞迁移和侵袭[10-11]。资料显示，利多卡因通过调节miR-145 表达抑制胃癌MKN45 细胞的活力、增殖、迁移和侵袭，同时增强细胞凋亡[12]。利多卡因通过调节胃癌细胞中的环状RNA ANO5/miR-21-5p/LIFR轴导致细胞增殖、迁移、侵袭减少，以及细胞凋亡增加[13]。在肝癌中，利多卡因通过靶向肝癌细胞中的环状RNA DYNC1H1/miR-520a-3p/USP14 轴来阻止肿瘤进展[14]。本研究探讨了利多卡因对胃癌SNU-1 细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用。根据本研究的数据，50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L 利多卡因显著抑制SNU-1 细胞的增殖、迁移和侵袭，但促进细胞凋亡，这些发现与先前的研究一致。Cleaved Caspase-3 被认为是调节细胞凋亡的因子[15]。MMP2、MMP9 是迁移和侵袭的关键调节因子。本研究还发现利多卡因下调CyclinD1、MMP2 和MMP9 水平，同时促进Cleaved Caspase-3 表达，与SUI 等[12]报道的利多卡因下调胃癌MKN45 细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 表达及上调Cleaved Caspase-3 表达一致。总之，本研究的数据与之前的结果一致，这为利多卡因抗胃癌作用提供了新的证据。

作为细胞生长发育的重要调节因子，miRNA参与控制包括胃癌在内的多种癌细胞的增殖、凋亡和侵袭行为。miR-146b-5p是一种具有致癌[16]和肿瘤抑制活性[17]的癌症相关miRNA。最近，有人提出miR-146b-5p在胃癌中的表达增加[18-19]，诱导miR-146b-5p 的下调有助于治疗胃癌[9]或抑制结肠癌的生长和转移[20]。此外，miR-146b-5p 表达与晚期甲状腺乳头癌相关，miR-146b-5p 在体外促进甲状腺乳头癌细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期[21]。可见miR-146b-5p是胃癌、甲状腺乳头癌等的肿瘤促进剂。本研究的结果表明，沉默miR-146b-5p使SNU-1细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力减弱，而凋亡水平增加，与前人研究[9，20]吻合。利多卡因使SNU-1 细胞中的miR-146b-5p 表达减少，猜测利多卡因可以通过降低miR-146b-5p水平来阻滞胃癌的发生发展。此前，一些miRNA被报道参与利多卡因的抗癌功能，如利多卡因抑制肺癌A549 和NCI-H1299细胞的增殖和转移，同时诱导细胞凋亡，机制与上调miR-539有关[22]。利多卡因通过下调miR-10b减轻顺铂耐药，并抑制胃癌顺铂耐药细胞的迁移和侵袭[23]。进一步的结果表明，miR-146b-5p 高表达逆转了利多卡因诱导的SNU-1 细胞增殖、迁移、侵袭的降低和细胞凋亡的增加。此外，miR-146b-5p 高表达逆转了利多卡因诱导的增殖、转移和凋亡相关蛋白的变化。因此，利多卡因对胃癌细胞具有抗生长和抗转移作用，其抗肿瘤特性可能是通过下调miR-146b-5p 实现的。

总之，本研究阐明了利多卡因在胃癌中发挥抗生长和抗转移作用的机制，利多卡因通过下调miR-146b-5p来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并加速凋亡，为利多卡因在胃癌中的作用机制提供了新的见解。