利多卡因抑制ERK信号通路激活降低甲状腺癌细胞TPC-1的增殖能力

吴毅，刘付宁，严颖哲，杨浩杰，谢乾

研究及临床实践表明，局部麻醉和局麻药可能提高肿瘤患者的预后［1-5］。利多卡因由于其起效快、毒性作用小而广泛应用于体表手术［6］。多项研究发现，利多卡因可影响TRPM7（transient receptor potential melastatin-subfamily member 7）的功能，TRPM7可能是利多卡因在某些类型肿瘤中的靶点，例如，胶质瘤、乳腺癌等［7，8］。另有文献报道，利多卡因和罗哌卡因可抑制TNF-α（TumourNecrosis Factor-alpha）激活的SRC信号通路降低肺癌转移能力［9］。也有研究证实，利多卡因可通过EGFR（epidermal growth factor receptor）信号通路抑制结肠癌的增殖，促进其凋亡［10］。还有研究表明，利多卡因可能通过抑制NF-κB通路进而抑制细胞粘附因子表达并抑制肝癌细胞粘附于血管内皮细胞［11］。

生理情况下，细胞外信号调节激酶ERK（extracellular regulated MAP kinase）信号通路在发育和免疫中发挥重要作用［12，13］。而在肿瘤进程中，它通常处于被激活和上调状态，可以促进肿瘤的增殖、分化、运动等［14］，所以ERK是许多药物抑制肿瘤的重要靶点［15，16］。多项研究证实，甲状腺癌的增殖转移能力与ERK信号通路激活有关［17，18］。然而，利多卡因对甲状腺肿瘤细胞的影响及其机制仍不清楚。本项研究中，我们通过体内外实验检测了利多卡因对甲状腺癌细胞增殖能力的影响。此外，我们探究了利多卡因影响肿瘤增殖的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 TPC-1细胞购自中科院细胞库（上海，中国）。

1.1.2 试剂 RPMI1640培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自GIBCO；链霉素和青霉素购自Sigma；细胞裂解液购自碧云天；磷酸酶蛋白酶抑制剂、Erk1/2、p-Erk1/2、GAPDH一抗，二抗购自Cell Signaling Technology；周期试剂盒购自凯基生物；CCK8购自日本同仁；利多卡因购自郑州卓峰制药有限公司；

1.1.3 仪器设备 Western Blot机器购自Bio-rad；酶标仪购自Thermo Fisher Scientific；0.45μm PVDF膜购自Merck。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RPMI1640培养基加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100μg/mL链霉素，混匀，4℃冰箱存储备用。TPC-1细胞在含有5%CO2，37℃的培养箱中培养。

1.2.2 CCK8 将对数生长期的TPC-1细胞用胰蛋白酶消化种在96空板，约5000个细胞，6 h后加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培养基200 mL，分别在处理24 h、48 h、72 h后使用CCK8试剂检测TPC-1增殖情况，详细步骤见试剂盒说明书。本项研究所使用的利多卡因的浓度参考既往发表的文献［8，10］。

1.2.3 周期实验 将对数生长期的TPC-1细胞用胰蛋白酶消化种在6空板，约1.5×105，6 h后换成不含血清的培养基，24 h后细胞密度约为50%～60%，分别加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培养基200 mL。孵育48 h，消化细胞，离心，将细胞在4℃的75%酒精中混匀，流式细胞仪检测。

1.2.4 Western Blot 使用含蛋白酶磷酸酶抑制剂的细胞裂解液在冰上孵育细胞30 min，刮取细胞，收集在1.5 mL EP管中，4℃下12 000 g离心30 min；吸取上清液，检测蛋白浓度，加入loading buffer和H2O，配成每管15μg蛋白样品；分别取蛋白进行电转膜，一抗（1∶1000）孵育12 h，TBST液中漂洗3次，10 min/次；孵育二抗，2 h，漂洗条件同上；条带上加曝光液在曝光机曝光。

1.2.5 数据分析 使用SPSSstatistic19分析实验数据，CCK8、细胞周期实验、Western Blot实验至少重复三次，数据用均数±均数的标准误差表示。P＜0.05则认为有统计学差异。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

1.2.6 皮下成瘤实验动物实验 得到了中山大学动物伦理委员会批准；BALB/C裸鼠购自中山大学东校区动物实验中心，4～6周雄鼠，随机分为两组（n=6），用来检测利多卡因对TPC-1增殖的影响。6×106个细胞重悬在150μL的PBS中，皮肤消毒后使用1 mL的胰岛素针注射在裸鼠的背部，种植7天后肿瘤块的直径约2 mm。成瘤的第5天，两组裸鼠分别以100μL/10 g的量在肿瘤周围注射PBS和利多卡因（浓度10 mg/mL），隔天注射1次，总计注射5次，注射的当天使用游标卡尺检测肿瘤块的长径和横径，每3天量一次，总计10次［19］。

2 结果

2.1 利多卡因抑制TPC-1细胞的增殖

为研究利多卡因对甲状腺癌细胞增殖的影响，本研究采用PBS和10μM、100μM利多卡因处理TPC-1细胞24 h、48 h、72 h。CCK8结果显示，10μM、100μM利多卡因均可抑制TPC-1细胞的增殖能力，且100μM利多卡因抑制作用强于10μM的利多卡因（图1-A）。流式细胞学结果显示10μM、100μM利多卡因处理TPC-1细胞48 h后，S期细胞比值降低，G0/G1期细胞比值增加（图1-B）。Western Blot结果显示，10μM、100μM利多卡因处理TPC-1细胞48 h后P21、P27蛋白表达量升高，ERK蛋白表达量下调，100μM利多卡因处理组p-ERK蛋白表达下调较显著（图1-C）。

图1 利多卡因抑制甲状腺癌TPC-1细胞增殖 A：CCK8实验检测不同浓度的利多卡因对TPC-1细胞增殖的影响；B：流式细胞学实验检测不同浓度利多卡因对TPC-1细胞周期的影响；C：Western blot实验检测不同浓度利多卡因对周期相关蛋白及ERK信号通路的影响。Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05，**P＜0.001；每组实验至少重复3次

2.2 利多卡因抑制TPC-1细胞移植瘤增殖

为了进一步探讨利多卡因在动物体内对TPC-1细胞增殖的影响，我们使用BALB/C裸鼠建立甲状腺癌移植瘤模型（图2-A）。我们将利多卡因注射在肿瘤周围，实验结束后麻醉处死裸鼠取出肿瘤块拍照（图2-B），实验期间记录肿瘤块的大小变化（图2-C）。实验结果表明，利多卡因可抑制TPC-1细胞在裸鼠体内生长。

图2 利多卡因抑制BALB/C裸鼠移植瘤生长 A：第37天处死裸鼠取出背部肿瘤；B：PBS和利多卡因注射肿瘤周围后瘤体体积变化曲线。n=6，Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05

3 讨论

局部麻醉药利多卡因浸润复合术中镇静是甲状腺癌手术的麻醉方式之一，因其可减少对患者呼吸循环系统的抑制、降低患者费用，缩短住院时间而受到推崇［19-21］。既往研究报道利多卡因等其他局麻药可以抑制乳腺癌等恶性肿瘤细胞的进程［22，23］。但是，目前关于利多卡因对甲状腺肿瘤细胞的影响鲜有报道。因此，研究利多卡因对甲状腺肿瘤的影响及其机制可对麻醉医师做出最佳选择提供理论依据。

为了探究利多卡因对甲状腺癌细胞的影响，本研究检测利多卡因对甲状腺癌细胞TPC-1增殖的影响，又对其可能机制进行初步探究。本研究在10μM、100μM利多卡因处理甲状腺癌细胞TPC-1后，利用CCK8实验检测利多卡因对TPC-1细胞增殖能力的影响，结果显示利多卡因在两种浓度下均可抑制TPC-1细胞增殖，且100μM利多卡因抑制作用强于10μM。之后，利用流式细胞学检测处理后细胞周期，结果显示利多卡因两种浓度处理后均有S期细胞比值降低，G0/G1期细胞比值增加。为了探究利多卡因抑制TPC-1细胞增殖的机制，我们对利多卡因处理后TPC-1细胞表达的蛋白进行Western Blot实验，结果显示利多卡因两种浓度处理后均有p21、p27蛋白表达量升高，ERK及其磷酸化水平降低，表明利多卡因抑制TPC-1细胞增殖的机制可能与ERK信号通路相关。裸鼠皮下成瘤实验检测利多卡因对皮下移植TPC-1细胞的影响，结果显示利多卡因可抑制肿瘤细胞在裸鼠体内生长。

综上所述，利多卡因处理甲状腺癌细胞可抑制其增殖能力，这可能与抑制ERK信号通路有关。