离子色谱-脉冲安培法测定糖果中的D-甘露糖醇

俞所银，聂 磊，闫 晴

（1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.国家保洁产品质量监督检验中心（上海），上海 200233；3.上海食品快速检测工程技术研究中心，上海 200233）

0 引言

D-甘露糖醇（D-Mannitol）又叫己六醇、甘露醇等，广泛存在于多种陆地和海洋植物中，如橄榄、柿子树和藻类等。因保湿补水、双糖代用剂和制备利尿剂等功效在医药、食品和饲料等领域被广泛使用。目前针对D-甘露糖醇分离检测的研究不多，更多的是作为某一种方法同时测定、分离多种糖或糖醇中的一种［1］。市场上出现了很多添加了D-甘露糖醇的无糖食品，已经成为糖尿病患者饮食行业的一个销售亮点，企业将其作为代糖食品为宣传卖点，实际产品中添加的量由于没有相应的检测而不得而知。D-甘露糖醇在产品中的添加，可能涉及到产品标签整改，虚假宣传；且添加量高则可能不被人体代谢，造成肾脏损伤。目前，市场中使用D-甘露糖醇的糖果很多，尤其是无糖薄荷糖和口香糖，但是由于缺乏相应的检测方法，政府部门对其监管以及企业对产品质量的提升均缺少有力的手段，因此建立一种适用食品中D-甘露糖醇的检测方法显得尤为重要。

现行有效的GB 1886.177-2016《食品添加剂D-甘露糖醇》只规定了淀粉、淀粉糖或蔗糖为原料制得的食品添加剂D-甘露糖醇的鉴别试验、理化指标的测定［2］，操作相对复杂，且对低含量添加灵敏度和准确性不高。而现行食品中D-甘露糖醇含量尚无检测方法。针对糖醇类物质的检测，主要是比色法［3］、高效液相色谱法和高效离子色谱法等［4-10］。比色法操作简单，成本低，但是抗干扰性差，对于复杂样品定量不准确；高效液相色谱法使用示差或者蒸发光检测器，稳定性好，前处理方便，但是对于糖类检测的灵敏度不够，难以满足低含量样品的检测；离子色谱法前处理简单，灵敏度高，适合复杂样品的分析。

本文采取离子色谱脉冲安培检测器（ion chromatography with pulsed amperometricdetection，IC-PAD），利用糖类在强碱性条件下呈现离子状态，可在阴离子色谱柱上被分离出来的特性进行检测，实现对糖果中D-甘露糖醇含量的定量分析，方法快速高效，适用于大批量样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

ICS-5000 型离子色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司，配备电化学检测器）；电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器公司）；SK8210LHC 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q 型超纯水器（美国 Millipore 公司）；G560E型涡旋振荡器（美国Scientific Industries 公司）；5804 型高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；0.22µm Filter Unit 滤膜（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

D- 甘露糖醇标准品（纯度99%，德国Dr.ehrenstorfer 公司）；山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖标准品（纯度>98%，美国A ChemTek，Inc 公司）；亚铁氰化钾、乙酸锌（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，美国Sigma 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

胶基糖果（口香糖）：准确称取样品1 g（精确到0.001 g）于50 mL 具塞玻璃管中，加入6 mL 水，涡旋1 min；80 ℃水浴加热至全溶，涡旋1 min；冷却至室温后，缓慢加入亚铁氰化钾（106 mg/mL）和乙酸锌（219 mg/mL）各1 mL，用水定容到10 mL，涡旋1 min；以9 000 rad/min 离心作用2 min，过0.22 µm（PTFE）微孔滤膜至样品瓶，待测。

其他糖果（硬糖、软糖、凝胶糖果）：准确称取样品1 g（精确到0.001 g）于50 mL具塞玻璃管中，加入6 mL 水，涡旋1 min；80 ℃水浴加热至全溶，涡旋1 min；冷却至室温后，用水定容到10 mL，涡旋1 min；以9 000 rad/min 离心作用2 min，过0.22µm（PTFE）微孔滤膜至样品瓶，待测。

1.2.2 标准曲线的配制

D-甘露糖醇标准储备液（1.0 mg/mL）：称取0.010 0 g（精确到0.000 1 g）D-甘露糖醇于10.0 mL 容量瓶中，用水溶解并定容到刻度，4 ℃冰箱中保存一个月。

D-甘露糖醇标准中间液（100 µg/mL）：吸取D-甘露糖醇标准储备液1 mL 于10.0 mL 容量瓶，加水定容至刻度。

D-甘露糖醇标准工作液：分别吸取0.10，0.20，0.50，0.80，1.00 mL 甘露糖醇标准中间液于10.0 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，相当于1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 µg/mL 浓度标准工作溶液。

1.2.3 离子色谱分析条件

色谱柱为Dionex CarboPacTMMA1 BioLCTM（4×250 mm）分离柱，流动相为500 mmol/L 氢氧化钠，等度洗脱；流速为0.45 mL/min；进样量25 µL；柱温为30 ℃；检测器为安培电化学检测器。脉冲积分安培检测器（工作电极：Au 电极；参比电极：Ag/AgCl 电极）。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

对于食品中的糖醇测定，目前现行标准中只有GB 5009.279-2016《食品中木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇的测定》，使用该液相方法测定D-甘露糖醇时，山梨糖醇和D-甘露糖醇出峰时间重合，无法分离，如图1所示。

图1 D-甘露糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麦芽糖醇的混合标准溶液HPLC 色谱图Fig.1 Liquid chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol

离子色谱分离糖醇常用的色谱柱有PA1、PA20 和MA1 等，分别使用上述3 种色谱柱对D-甘露糖醇进行分析。使用PA1 和PA20 色谱柱分离时，由于糖醇的保留时间较短，出峰时间过早（5 min 前），如图2、图3所示。在对实际样品分析时，基质干扰很大，不适于复杂样品分析。

图2 D-甘露糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麦芽糖醇混合标准溶液的PA1 柱色谱图Fig.2 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by PA1 column

图3 D-甘露糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麦芽糖醇混合标准溶液的PA20 柱色谱图Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by PA20 column

MA1 色谱柱保留时间适中，更适用于糖醇的分析。由于MA1 色谱柱对于氢氧化钠梯度变化不敏感，且不适于使用醋酸钠，所以选择氢氧化钠等度洗脱。通过比较不同浓度的氢氧化钠浓度（500，300，250，200 mmol/L），考察保留时间、峰形和抗干扰情况，最终选择500 mmol/L 氢氧化钠等度洗脱50 min 作为流动相条件。在此条件下D-甘露糖醇的峰形对称且具有良好的保留时间，不受常见的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的干扰。对于无糖食品中经常使用的木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇和赤藓糖醇也可以有效分离，如图4所示。

图4 D-甘露糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麦芽糖醇的混合标准溶液的MA1 柱色谱图Fig.4 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by MA1 column

2.2 加热温度的确定

选择成分比较复杂的基质糖果（口香糖）作为空白基质，加入相同质量浓度的D-甘露糖醇标准溶液，分别选取60，80，100 ℃作为低、中、高3 个温度点［11］，在相同条件下对分析物进行测定，结果如图5所示。加热20 min 后80，100 ℃样品全部溶解，提取率分别为98.29%，98.63%，而60 ℃加热20 min 的样品没有完全溶解，提取率仅为62.33%。综合考虑选择80 ℃作为提取温度。

图5 不同提取温度对D-甘露糖醇提取效率的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on D-mannitol extraction efficiency

2.3 前处理条件的优化

在糖果中除去琼脂、变性淀粉、明胶和果胶等凝固剂、色素和蛋白质后，再进行后续分析，有利于延长色谱柱寿命和降低分析干扰。本文通过不同的沉淀方法，考察其提取效率。在空白的胶基糖果中，加入相同质量浓度的D-甘露糖醇，分别使用乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液（1∶1；V∶V）、3%的乙酸溶液、乙腈和乙醇作为沉淀蛋白质的试剂［12］，在相同的条件下对D-甘露糖醇进行测定。使用乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液的样品的D-甘露糖醇提取率最好，结果如图6所示。故选择乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液作为沉淀试剂。

图6 不同沉淀方式对D-甘露糖醇提取效率的影响Fig.6 The effects of precipitation methods on D-mannitol extraction efficiency

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围、检出限和定量限

将甘露糖醇的标准工作溶液按离子色谱条件进行分析，以峰面积对浓度作标准曲线。其中以对应的色谱峰面积为纵坐标y，待测组分的质量浓度为横坐标x，绘制标准工作曲线。经线性回归后求得相关系数，以及分别计算出检出限（LOD）、定量限（LOQ），结果如表1所示。

表1 D-甘露糖醇的线性方程、检出限和定量限Tab.1 Linear equation，limits of detection and limits of quantification of D-mannitol

2.4.2 方法的准确度和精密度

选取3 种有代表性的阴性空白样品基质（凝胶糖果、口香糖、硬糖），分别按0.001%，0.002%，0.005%水平进行加标回收试验，每个添加水平做6 次平行试验。检测结果如表2所示，方法回收率在77.8%～117.9%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）为1.77%～9.41%，均小于10%，具有较高的准确性。

表2 3 种糖果中D-甘露糖醇含量的回收率和精密度实验结果（n=6）Tab.2 Recoveries and relative standard deviations of D-mannitol in three kinds of candies （n=6） （单位：%）

2.5 实际样品测定

采用已建立的方法对上海市和苏州市抽查糖果30 份（凝胶糖果10 份、口香糖10 份、硬糖10 份）进行D-甘露糖醇检测，其中凝胶糖果7 份样品被检测出D-甘露糖醇，含量在0.001 099%～0.836 8%，3 份未检出。口香糖9 份样品被检测出D-甘露糖醇，含量在1.018 1%～1.817%，仅1 份未检出。硬糖9 份样品被检测出D-甘露糖醇，含量在0.000 519%～0.605 8%，1份未检出。

3 结语

本文建立离子色谱-脉冲安培检测器测定糖果中D-甘露糖醇含量的方法，前处理简单，抗干扰性强，稳定性高，适合大批量样品的检测。该方法的建立填补现行检测方法的空白，可以为企业提高产品质量提供技术支持，同时为政府监管部门进行风险监测提供有效的技术支撑。