circRNA_103809 对结肠癌SW480 细胞线粒体功能和炎症因子水平的调节作用①

李 毅 李文忠 师 路 高志勇 王聆宇

（西南医科大学附属成都三六三医院胃肠外科，成都 610097）

结肠癌（colon cancer，CC）是人类最常见、最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其病死率在恶性肿瘤中排名第二［1］。由于其发展速度快及高度转移性，治疗策略受到限制［2］。因此，急需发现用于早期检测、术后监测和管理的新型生物标志物。环状RNA（circular RNAs，circRNAs）是一类新型的非编码RNA，具有闭环结构且缺乏编码潜力［3］。随着高通量测序方法的发展，circRNAs 在各种动物组织和细胞样品中表现出高丰度和高组织特异性表达［4］。重要的是，已有研究证明circRNA 失调与多种人类疾病（如神经系统疾病和癌症）有关［5-6］。据报道，circRNA_103809 可促进肺癌发展［7］。circRNA_103809 参与调控与肝癌和结直肠癌的发生［8-9］。在既往研究中，ZHANG 等［10］发现hsa_circRNA_103809在结直肠癌中下调，且与肿瘤分期和淋巴结转移有关。然而hsa_circRNA_103809 在结直肠癌中的功能和机制尚未在体内或体外深入研究。本文主要探究hsa_circRNA_103809 在结肠癌中的表达及circRNA_103809对结肠癌SW480细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基、Trizol试剂和4%多聚甲醛溶液（美国Invitrogen）；10%胎牛血清（FBS，美国Gibco）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美国Sigma）；CCK8试剂盒、RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL 发光液和DAPI 染色液（上海碧云天）；Lipo⁃fectamine2000转染试剂和反转录试剂盒（美国Thermo Fisher）；SybGreenⅠ（上海捷瑞生物）；Annexin-V-PI（美国BD Pharmingen）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore）；兔抗胱天蛋白酶（caspase，cas）-3 抗体多克隆抗体（ab13847）、兔抗caspase-9 单克隆抗体（ab185719）、兔抗Bcl-2单克隆抗体兔抗（ab32124）、兔抗Bax 单克隆抗体兔抗（ab32503）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（ab205718）、HRP-兔抗小鼠IgG（ab6728）、山羊抗兔IgG（Alexa Fluor®488，ab150077）（英国Abcam）；小鼠抗Lamin A 单克隆抗体（#86846）、p65 单克隆抗体（#8242）（美国CST）；BD MitoScreen（JC1）试剂盒（美国BD Biosci⁃ences）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）测定试剂盒（美国Sigma-Aldrich）；IL-1β、IL-6和IL-4 ELISA试剂盒（美国R&D Systems 公司）；酶标仪（美国BioTek）；SmartSpec Plus 分光光度计Accuri C6 流式细胞仪（美国BD Biosciences）；ABI PRISM7500PCR 仪（美国Applied Biosystems）；光学显微镜（日本尼康）；LV-circRNA_103809、LV-scramble（中国广州锐博生物）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人正常结肠上皮细胞FHC 及结肠癌细胞系HCT116、SW620、SW480和HT29均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。细胞均在37 ℃、5%CO2的潮湿空气中，在添加有10%FBS 和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。

1.2.2 结肠癌患者样品检测 临床获取25例结肠癌组织样本和癌旁组织样本，qRT-PCR 检测circ-RNA_103809的表达水平。

1.2.3 细胞分组及转染 将SW480 细胞分为对照组（不转染），circRNA_103809 过表达组（LV-circ-RNA_103809组）及其阴性对照组（LV-scramble组）。SW480细胞（1×106个/孔）接种于6个孔板，培养24 h后，使用Lipofectamine2000 转染试剂分别对应分组将100 nmol/L LV-circRNA_103809和LV-scramble转染细胞。

1.2.4 CCK8 检测细胞增殖能力 将SW480 细胞按1.2.3 分组转染24 h，10 µl CCK8 溶液添加到平板的每个孔中。37 ℃下孵育1 h，使用酶标仪测量450 nm 处吸光度，孵育4 d，通过测量450 nm 处的吸光度评估活细胞数量。

1.2.5 qRT-PCR 检测circRNA_103809、Ki67 和p21mRNA 的表达 根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从结肠癌组织、癌旁组织和结肠癌细胞中提取总RNA。SmartSpec Plus 分光光度计中测量RNA 浓度和纯度。A260/A280在1.8～2.0 之间表示RNA 纯度高，用于进一步检测。按照cDNA 逆转录试剂盒和qPCR 试剂试剂盒的说明书分别将RNA 逆转录成cDNA 并制备qPCR 体系。使用ABI PRISM7500 系统定量，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，65 ℃退火延伸30 s，40个循环。引物序列如下：circRNA_103809 正向引物为5'-ACGCATTCTTC⁃GAGACCTCT-3'，反向引物为5'-TGCCTGTAACTCCTCTTCAGT-3'；GAPDH 正向引物为5'-GAAGGT⁃GAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物为5'-GAAGATG⁃GTGATGGGATTTC-3'；Ki67 正向引物为5'-ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG-3'，反向引物为5'-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3'；p21 正向引物为5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，反向引物为5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'。将GAPDH 水平用于标准化circRNA 和mRNA 相对表达，应用2-ΔΔCt计算。每个样品进行重复分析3次。

1.2.6 Annexin-V-FITC/PI 染色 收集按1.2.3 步骤转染的48 h 的各组SW480 细胞，PBS 洗涤3 次，4 ℃、1 000 g 离心5 min，弃上清液，将细胞重悬于膜联蛋白结合溶液，10µl膜联蛋白V 悬浮。室温下避光添加异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）溶液。15 min后，采用流式细胞仪检测凋亡。

1.2.7 蛋白质印迹分析 收获SW480 细胞并用细胞裂解缓冲液裂解以进行免疫印迹。蛋白质（每泳道30 µg）以10%SDS-PAGE 凝胶分离，转移至聚偏二氟乙烯膜。含5%牛奶Tween20（TBST）的Tris 缓冲盐水室温封闭膜1 h，与一抗β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase3（1∶500）、caspase9（1∶1 000）、p65（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤3次后，将膜与抗兔、抗鼠IgG-HRP 偶联的二抗（1∶4 000）37 ℃孵育1 h。TBST 洗涤3 次后，使用ECL 发光液检测免疫反应带。

1.2.8 线粒体膜电位的测量 根据制造商的说明，使用BD MitoScreen 试剂盒评估ΔΨm 的变化。将SW480 细胞按照1.2.3 分组转染48 h 后，收获细胞并用PBS 洗涤2 次。然后将细胞悬浮在500 µl JC-1 工作溶液中，并在37 ℃孵育30 min。通过流式细胞仪记录总共1×104个细胞，采用BD CFlow 软件分析。

1.2.9 SOD 和MDA 测定 SW480 细胞按照1.2.3分组转染48 h 后，离心获取细胞并裂解，收集上清液，并通过BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。根据生产商的说明，将裂解液（35 µg）用于测定SOD 和MDA活性。

1.2.10 ELISA 检测炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-4收集各组转染SW480 细胞，离心10 min。收集上清液，使用ELISA 试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α，每个样品重复3次。

1.2.11 免疫荧光染色检测NF-κBp65 的核定位将各组转染SW480 细胞用溶于0.1%Triton100-PBS的4%多聚甲醛溶液固定20 min，5%BSA-PBS 封闭1 h。细胞与抗NF-κBp65 抗体在2%BSA-PBS 中于4 ℃孵育过夜。Alex Fluor 488 山羊抗兔IgG 的2%BSA-PBS 溶液作为二抗，避光孵育1 h。DAPI 对细胞核染色1 min，荧光显微镜拍摄图像。

1.3 统计学分析 所有数据均表示为至少3 个独立实验的±s，使用SPSS19.0 软件的单因素方差分析（one-way ANOVA）统计分析，P<0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA_103809 对结肠癌细胞增殖能力的影响 如图1 所示，与人正常结肠组织及上皮细胞相比，结肠癌组织及各结肠癌细胞中circRNA_103809的表达显著下调（P<0.05），选择表达相对低的SW480 继续实验。与对照组相比，LV-circRNA_103809 组SW480 细胞中circRNA_103809 表达显著上调（P<0.05），细胞活性显著降低（P<0.05），Ki67表达显著下调（P<0.05），p21 表达显著上调（P<0.05），LV-scramble组差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 circRNA_103809抑制结肠癌SW480细胞增殖Fig.1 circRNA_103809 inhibits proliferation of colon can⁃cer SW480 cells

2.2 circRNA_103809 对结肠癌SW480 细胞凋亡的影响 如图2 所示，与对照组相比，LV-circRNA_103809 组SW480 细胞凋亡率显著升高（P<0.05），LV-scramble 组细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 circRNA_103809诱导结肠癌SW480细胞凋亡Fig.2 circRNA_103809 induces apoptosis of colon cancer SW480 cells

2.3 circRNA_103809 对结肠癌细胞线粒体功能的影响 如图3所示，与对照组相比，过表达circRNA_103809降低SW480细胞线粒体膜电位，并显著上调Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3（P<0.05）。LV-scramble组差异无统计学意义（P>0.05）。

图3 circRNA_103809 对结肠癌SW480 细胞线粒体功能的影响Fig.3 Effect of circRNA_103809 on mitochondrial func⁃tion of colon cancer SW480 cells

2.4 circRNA_103809 对结肠癌细胞氧化应激的影响 如图4 所示，与对照组相比，过表达circRNA_103809减少SW480细胞中SOD含量（P<0.05），增加MDA 含量（P<0.05），LV-scramble 组差异无统计学意义（P>0.05）。

图4 circRNA_103809对结肠癌SW480细胞氧化应激的影响Fig.4 Effect of circRNA_103809 on oxidative stress of colon cancer SW480 cells

2.5 circRNA_103809 对结肠癌SW480 细胞炎症反应的影响 如图5 所示，与对照组相比，LV-circ-RNA_103809 组SW480 细胞上清液中IL-1β 和IL-6水平显著降低（P<0.05），IL-4 水平显著升高（P<0.05），SW480 细胞核中p65 表达显著下调，免疫荧光结果显示过表达circRNA_103809 减少p65 的细胞核定位。LV-scramble 组差异无统计学意义（P>0.05）。

图5 circRNA_103809 对结肠癌SW480 细胞炎症反应的影响Fig.5 Effect of circRNA_103809 on inflammatory response of colon cancer SW480 cells

3 讨论

结肠癌是一种恶性肿瘤，发病率高，一般认为与环境因素、遗传因素有关［11］。结肠癌常规治疗包括手术，辅助治疗和分子靶向治疗，但预后不理想［12-13］。因此有必要进一步研究结肠癌的发生发展及其潜在分子机制，为结肠癌的诊断和治疗提供理论依据，以改善患者预后并减轻患者痛苦。越来越多的研究表明，circRNA 在生命过程中许多方面都发挥至关重要的作用，例如分化、增殖、转移和侵袭。例如circRNA-CDR1as（与小脑变性相关蛋白1转录物反义）可通过影响miR-7 表达参与多种癌症生物学功能［14］。BIAN 等［8］研究表明Hsa_circRNA_103809 在大肠癌组织中的表达显著下调，并通过miR-532e3p/FOXO4轴调控大肠癌细胞增殖和迁移。本研究结果与之一致，结果显示circRNA_103809 在结肠癌组织与细胞中的表达较正常组织和细胞显著降低。进一步过表达circRNA_103809，则SW480细胞活力显著下降，Ki67 表达显著下调，p21 表达显著上调。因此，过表达circRNA_103809 能抑制SW480细胞增殖。

凋亡是消除癌细胞的主要机制，可以用作癌症药物开发研究的重要靶标［15］。本研究表明过表达circRNA_103809 可诱导SW480 凋亡，线粒体膜电位降低，促进凋亡蛋白表达上调，Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 比值显著升高。线粒体跨膜电位降低是细胞凋亡早期的不可逆事件［16］。抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 同属于Bcl-2 家族，是细胞凋亡内源性线粒体途径的重要调节因子［17］。线粒体膜通透性增加，线粒体释放细胞色素到细胞质中，会激活cas-9，进而导致cas-3 的裂解，最终导致细胞凋亡［18］。

肿瘤治疗过程中常以抗氧化酶为作用靶点，通过降低抗氧化剂（如SOD）水平导致细胞损伤和死亡而具有抗癌作用［19］。MDA 水平作为脂质过氧化的标志物，通常用作细胞和组织中氧化损伤的标志［20］。本研究表明过表达circRNA_103809 降低SW480 细胞中SOD 水平，升高MDA 水平，通过增强氧化应激诱导细胞凋亡。

炎症在癌症发展中发挥重要作用，其不仅具有肿瘤促进剂的作用，还能通过诱导血管生成、侵袭和转移而影响肿瘤发生的进程［21-22］。本研究结果表明过表达circRNA_103809 可显著下调促炎因子IL-1β 和IL-6 表达，上调抗炎因子IL-4 表达，显著下调NF-κB p65 表达并减少p65 的核定位。NF-κB 对许多控制各种细胞反应（例如凋亡，应激和炎症）的靶基因发挥作用。临床和实验室研究表明NF-κB途径参与多种人类疾病，例如心肌病、糖尿病肾病、白内障和癌症［23-26］。NF-κBp65 作为NF-κB 家族重要成员，与各种刺激、应激有关，尤其是氧化应激［27］。受刺激时，NF-κB被激活并转移到细胞核中。因此circRNA_103809 通过调控NF-κBp65 的核定位抑制炎症反应，从而阻止肿瘤发生进程。

综上所述，circRNA_103809 在结肠癌中表达下调，并通过降低细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强应激反应和抑制炎症发挥抑癌功能。这些结果提示circRNA_103809可能是一种新型治疗靶标。