miR-125b对过敏原刺激后支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子的作用

肖惠玲 李艳红 赵 申 李俊杰 （湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院儿科，襄阳 441000）

支气管哮喘是一种十分常见的呼吸系统炎症性疾病，不同患者哮喘严重程度差距明显，目前临床上用于哮喘治疗的药物主要是糖皮质激素等，部分患者经这些药物治疗后症状明显改善，但有些患者出现激素抵抗，治疗效果不佳现象［1］。免疫-炎症反应、支气管上皮细胞过度凋亡等是目前公认的哮喘发病机制［2］。近年来，哮喘已被证实是由多种基因调控引起，且分子靶向治疗也成为哮喘治疗的潜在途径［3］。miRNA 的长度为20～24 nt，是一种内源性的小分子RNA，没有编码蛋白质的作用，其主要通过影响下游靶基因和信号通路发挥作用［4］。miRNA不仅与胚胎发育和机体稳态维持有关，还与炎症、细胞凋亡、细胞生长、肿瘤等进程关系密切［5］。miR-125b 为miR-125 家族成员，也是miR-125 家族中较为活跃的成员，miR-125b 在肿瘤、脑梗死、阿尔茨海默病等进展中发挥调控作用［6］。既往研究显示，miR-125b 与哮喘有关，在哮喘患者中发现miR-125b表达下调，且上调miR-125b能够抑制尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎症［7］。现阶段仍不明确miR-125b在过敏原刺激后支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌中的作用。有研究发现，miR-125b 抵抗骨关节炎软骨细胞炎症分泌与下调NF-κB 信号有关［8］。NF-κB 信号通路在人体组织中广泛存在，是典型的炎症反应枢纽，其激活能够诱导下游炎症因子释放，促进炎症反应［9］。另外，NF-κB 还参与调控细胞凋亡过程，是一个多功能信号通路［10］。本实验以尘螨抗原提取物刺激支气管上皮细胞系16HBE 进行体外研究，探讨miR-125b 在哮喘支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子中的作用和可能机制，为分子靶向治疗哮喘提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 支气管上皮细胞系16HBE 购自通派（上海）生物科技有限公司；mimics control、miR-125b mimics购自百奥迈科生物技术有限公司；Lipo⁃fectamine2000 试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；Bax 抗体、p65 抗体购自美国Santa Cruz；Bcl-2抗体购自美国BioVision；IL-29检测试剂盒购自美国Abcam；IL-6 检测试剂盒购自美国Cayman Chemical；尘螨抗原提取物（安脱达）购自丹麦ALK-Abello A/S。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染处理 支气管上皮细胞接种于6 孔板，以不含青链霉素的细胞培养液培养，24 h 后观察细胞密度为80%，转染mimics control、miR-125b mimics。转染试剂为Lipofectamine2000，转染步骤按照转染试剂说明书进行。支气管上皮细胞分为Control 组、Model 组、miR-NC 组、miR-125b 组，miR-NC 组、miR-125b 组在用300 U/L 尘螨抗原提取物刺激前转染mimics control、miR-125b mimics。Control 组、Model 组均为没有转染的正常支气管上皮细胞，Model 组细胞用300 U/L 尘螨抗原提取物刺激。各组细胞培养24 h以后，用于后续实验检测。

1.2.2 qRT-PCR 分析miR-125b 表达 在Control组、Model 组、miR-NC 组、miR-125b 组细胞中添加1 ml TRIzol试剂，按照常规方法提取细胞RNA，RNA溶解于0.1%的DEPC 水。以微量紫外分光光度计测定OD260/OD280，分析RNA 的浓度和纯度，RNA 置于-80 ℃冰箱内保存。分别在EP 管内添加如下试剂进行cDNA 合成：2µl 5×PrimeScript Buffer、0.5µl PrimeScript RT Enzyme mixⅠ、0.5µl RT引物、300 ng总RNA，最后添加RNAse Free dH2O 至10 µl，cDNA合成条件为：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min。PCR 反应体系为：5 µl SYBR Premix Ex Taq、0.2 µl ROX Reference DyeⅡ、1.0 µl cDNA、0.5 µl 正向引物和反向引物，最后添加ddH2O 至10µl。PCR 仪设置反应程序为：预变性（95 ℃30 s，1 个循环），PCR反应（95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 个循环）。根据反应的Ct 值，以2-ΔΔCt法计算miR-125b 的表达变化。miR-125b F：5'-TGAAGAACTGTCCTTACGTGACC-3'，miR-125b R：5'-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3'；U6 F：5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'，U6 R：5'-TGT⁃CATCATATTTGGCAGGTT-3'。

1.2.3 流式细胞术分析细胞凋亡 在Control、Model、miR-NC、miR-125b组细胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1 000 g 离心10 min，弃上清液，添加提前预冷的PBS 溶液洗涤细胞2 次。每组收集1×106个细胞，添加结合缓冲溶液400µl，吸取5µl PI和Annexin V-FITC溶液至细胞中，置于室温、避光环境中结合15 min。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.4 ELISA 分析IL-6、IL-29 水平 收集Control、Model、miR-NC、miR-125b组细胞培养液上清，ELISA法检测上清中IL-6、IL-29 含量，步骤完全参照IL-6、IL-29检测试剂盒。

1.2.5 Western blot 分析Bax、Bcl-2、p65 蛋白表达变化 在Control、Model、miR-NC、miR-125b 组细胞中加入以1∶99比例添加PMSF后的RIPA溶液，用移液器反复吹打混合后，冰上静置20 min。收集裂解溶液，以14 000 g 离心10 min，将上清溶液吸取、分装后置于-80 ℃冰箱中保存。按照BCA 方法检测蛋白浓度。在蛋白样品中添加5×SDS-PAGE 缓冲溶液，二者比例为4∶1，100 ℃孵育5 min，冷却后4 ℃备用。选择10%的分离胶及4%的浓缩胶进行SDSPAGE 电泳。每个孔中添加30µg蛋白样品，上层胶采用80 V 电压电泳20 min，下层胶采用110 V 电压电泳90 min。根据目的蛋白分子量大小裁剪NC膜，设置300 mA 电流转膜，转膜时间为90 min。以TBST 洗涤NC 膜，5 min/次，共洗涤3 次。将NC 膜置于封闭液（5%牛血清白蛋白）中，室温反应2 h。将NC 膜置于一抗溶液，4 ℃孵育8 h。然后将NC 膜置于二抗溶液，室温结合2 h。Bax、Bcl-2 一抗按照1∶1 000 稀释，p65 一抗按照1∶800 稀释，二抗按照1∶4 000 稀释。ECL 显色试剂盒显色。分析条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白表达水平进行半定量分析。

1.2.6 激活NF-κB 信号对miR-125b 调控支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌作用检测 取转染miR-125b mimics后的支气管上皮细胞，用含300 U/L尘螨抗原提取物和1 µmol/L NF-κB 信号激活剂PMA 的细胞培养液刺激24 h，记为miR-125b+PMA组，以miR-125b组为参照，按照1.2.3、1.2.4、1.2.5中流式细胞术、ELISA法、Western blot法分别检测细胞凋亡和分泌IL-6、IL-29 的水平以及Bax、Bcl-2、p65蛋白表达变化。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，两组间数据比较采用t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-125b mimics 对过敏原诱导的支气管上皮细胞中miR-125b表达的影响 Model组支气管上皮细胞中miR-125b 表达水平低于Control 组（P<0.05）。miR-125b组支气管上皮细胞中miR-125b表达水平高于miR-NC 组（P<0.05）。见表1。提示miR-125b mimics 提高过敏原诱导的支气管上皮细胞中miR-125b表达水平。

表1 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中miR-125b水平（±s）Tab.1 Level of miR-125b in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics trans⁃fection（±s）

表1 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中miR-125b水平（±s）Tab.1 Level of miR-125b in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics trans⁃fection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC group，2）P<0.05.

miR-125b level 1.00±0.12 0.43±0.061）0.44±0.04 0.95±0.132）96.296<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP

2.2 上调miR-125b对过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响 Model 组支气管上皮细胞凋亡率升高，Bax 蛋白表达增多，Bcl-2 蛋白表达减少，与Con⁃trol组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-125b组支气管上皮细胞凋亡率降低，Bax 蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增加，与miR-NC组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表2。提示上调miR-125b抑制过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡。

表2 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平（±s）Tab.2 Allergen-induced apoptosis rate and Bax and Bcl-2 protein levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

表2 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平（±s）Tab.2 Allergen-induced apoptosis rate and Bax and Bcl-2 protein levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05.

Bcl-2 0.65±0.05 0.29±0.041）0.30±0.04 0.38±0.032）154.364<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP Apoptosis rate/%7.52±0.65 26.85±2.111）24.96±2.87 14.21±1.332）201.902<0.001 Bax 0.26±0.03 0.85±0.091）0.87±0.07 0.43±0.042）216.677<0.001

图1 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡Fig.1 Allergen-induced apoptosis of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection

2.3 上调miR-125b 对过敏原诱导的支气管上皮细胞炎症因子分泌的影响 Model 组支气管上皮细胞分泌IL-6、IL-29水平升高，与Control组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-125b 组支气管上皮细胞分泌IL-6、IL-29 减少，与miR-NC 组相比，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。提示上调miR-125b抑制过敏原诱导的支气管上皮细胞分泌IL-6、IL-29。2.4 上调miR-125b 对过敏原诱导的支气管上皮细胞中NF-κB 信号通路的影响 Model 组支气管上皮细胞中p65蛋白表达水平升高，与Control组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-125b 组支气管上皮细胞中p65 蛋白表达水平降低，与miR-NC 组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表4。提示上调miR-125b 抑制过敏原诱导的支气管上皮细胞中NF-κB信号激活。

表4 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白水平（±s）Tab.4 Allergen-induced p65 protein level in bronchial epi⁃thelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

表4 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白水平（±s）Tab.4 Allergen-induced p65 protein level in bronchial epi⁃thelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC group，2）P<0.05.

p65 0.23±0.03 0.58±0.041）0.56±0.07 0.29±0.022）150.923<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP

图2 Western blot 检测miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白表达水平Fig.2 Western blot detection of p65 protein expression in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics transfection

表3 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞分泌IL-6、IL-29水平（±s，pg/ml）Tab.3 Allergen-induced IL-6 and IL-29 levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s，pg/ml）

表3 miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞分泌IL-6、IL-29水平（±s，pg/ml）Tab.3 Allergen-induced IL-6 and IL-29 levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05.

IL-29 52.69±4.72 169.85±15.481）167.55±16.27 83.74±6.392）223.777<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP IL-6 99.52±10.23 315.24±25.691）310.86±29.97 189.47±14.202）208.955<0.001

2.5 NF-κB 信号激活剂PMA 促进支气管上皮细胞中NF-κB 信号激活 miR-125b+PMA 组支气管上皮细胞中p65 蛋白表达水平升高，与miR-125b 组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表5。提示NF-κB信号激活剂促进支气管上皮细胞中NF-κB信号激活。

表5 PMA 处理和miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白水平（±s）Tab.5 Levels of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens after PMA treatment and miR-125b mimics transfection（±s）

表5 PMA 处理和miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白水平（±s）Tab.5 Levels of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens after PMA treatment and miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with miR-125b group，1）P<0.05.

p65 0.28±0.04 0.63±0.071）13.024<0.001 Groups miR-125b miR-125b+PMA tP

图3 Western blot检测miR-125b mimics和PMA对过敏原诱导的支气管上皮细胞中p65蛋白表达的影响Fig.3 Western blot detection of effect of miR-125b mimics and PMA on expression of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens

2.6 NF-κB信号激活剂PMA 对miR-125b影响过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子的作用 miR-125b+PMA 组支气管上皮细胞凋亡率升高，细胞中Bax 蛋白表达增多，Bcl-2 蛋白表达减少，细胞分泌的IL-6、IL-29增多，与miR-125b组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），见图4、表6。提示NF-κB 信号激活剂逆转miR-125b 影响过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子的作用。

表6 PMA 处理和miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2 蛋白水平及细胞分泌IL-6、IL-29水平（±s）Tab.6 Allergen-induced bronchial epithelial cell apoptosis，Bax and Bcl-2 protein levels，and cell secretion of IL-6 and IL-29 levels after treatment with PMA and miR-125b mimics transfection（±s）

表6 PMA 处理和miR-125b mimics 转染后过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡率和Bax、Bcl-2 蛋白水平及细胞分泌IL-6、IL-29水平（±s）Tab.6 Allergen-induced bronchial epithelial cell apoptosis，Bax and Bcl-2 protein levels，and cell secretion of IL-6 and IL-29 levels after treatment with PMA and miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with miR-125b group，1）P<0.05.

IL-29/（pg·ml-1）84.17±6.69 142.01±12.741）12.059<0.001 Groups miR-125b miR-125b+PMA tP Apoptosis rate/%13.56±1.20 22.84±1.651）13.646<0.001 Bax 0.45±0.05 0.75±0.071）10.462<0.001 Bcl-2 0.37±0.04 0.26±0.031）6.600<0.001 IL-6/（pg·ml-1）190.25±15.58 276.39±20.851）9.929<0.001

图4 miR-125b mimics和PMA对过敏原诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of miR-125b mimics and PMA on allergeninduced apoptosis of bronchial epithelial cells

3 讨论

哮喘有多种诱导因素，如气候变化、感染、精神因素、过敏原、药物等，尘螨是最常见的哮喘气道炎症诱导因子，也是气道高反应性发生的重要原因。尘螨刺激后的支气管上皮细胞脱落，细胞凋亡水平增加，同时产生大量炎症因子，这些炎症因子又可进一步刺激支气管上皮细胞，加速细胞凋亡［11-12］。IL-29是常见的哮喘炎症因子，其在哮喘患者中表达上调，IL-29具有促进CD4+T细胞分泌IL-6等炎症因子的作用，放大单核细胞炎症反应［13］。IL-6 介导Th1/Th2 及Th17/Treg 平衡，是与哮喘气道炎症密切相关的促炎因子［14］。细胞凋亡是一个复杂的过程，是细胞内多种基因经过复杂的调控网络呈现的最终表现，目前发现的与细胞凋亡有关的蛋白家族主要有Bcl-2等，根据在细胞凋亡中的作用，将Bcl-2蛋白家族中的蛋白成员分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax 是Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白，其表达升高后促进细胞凋亡；Bcl-2 是Bcl-2 蛋白家族中的抗凋亡蛋白，其表达升高后抑制细胞凋亡［15-16］。本实验显示，尘螨抗原提取物诱导后的支气管上皮细胞凋亡水平升高，细胞中Bax 蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，细胞分泌的IL-29、IL-6 水平升高，提示尘螨抗原提取物诱导支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌，说明成功构建了体外哮喘支气管上皮细胞模型。

哮喘的发生受细胞内多种基因的调控，阐明基因在哮喘发生中的作用对于分子靶向治疗哮喘具有重要意义［17］。miRNA 是研究较多的非编码RNA，在人体的不同组织和器官中均有表达，并发挥极为重要的作用，miRNA 在组织中的表达具有时序性、组织特异性，这与miRNA 的功能有关［18］。miR-125b参与肿瘤、心血管系统疾病、关节炎等疾病进程，在人体的不同组织中几乎均有表达［6，19-20］。既往研究发现，miR-125b 在哮喘患者中表达降低，且可上调miR-125b 抑制尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎症，改善气道损伤［7］。本研究发现，尘螨抗原提取物刺激后的支气管上皮细胞中miR-125b表达水平降低，且可上调miR-125b 表达水平抑制尘螨抗原提取物诱导的支气管上皮细胞凋亡和IL-29、IL-6 分泌，提示miR-125b 可能具有抑制哮喘支气管上皮细胞损伤的作用。

NF-κB是在B细胞中发现的一种核因子，NF-κB以二聚体的形式存在于细胞内，p65 是NF-κB 的关键亚单位，其表达水平高低与NF-κB 信号激活有关［21］。NF-κB 具有多种作用，如调控细胞生长、凋亡、分化、代谢、炎症等［22-23］。既往研究发现，NF-κB在哮喘中过度激活，NF-κB激活后诱导炎症发生，促进细胞凋亡，造成气道损伤，加重哮喘进程［9，11］。有报道显示，miR-125b 发挥抗炎作用与下调NF-κB 信号通路有关［8］。本研究发现，尘螨抗原提取物刺激后的支气管上皮细胞中p65 蛋白表达水平升高，而上调miR-125b 抑制p65 蛋白表达，NF-κB 信号激活剂逆转miR-125b 对尘螨抗原提取物刺激后的支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌，提示miR-125b通过抑制NF-κB 信号参与哮喘支气管上皮细胞损伤进程。

综上所述，miR-125b 可能是哮喘治疗的分子靶点，上调miR-125b抑制尘螨抗原提取物诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌，其机制与下调NF-κB 信号通路有关。目前尚不清楚miR-125b 通过何种具体靶向机制影响NF-κB 信号进而参与哮喘进程，课题组在以后实验中会进行深入研究。